Os vírus entéricos são encontrados principalmente em diferentes reservatórios aquáticos, incluindo água subterrânea, água parada, córregos, rios e água r. Eles estão associados a riscos à saúde e são responsáveis por infecções em humanos. Vírus entéricos geralmente causam gastroenterite e são transmitidos principalmente pela rota fecal-oral.
Outras doenças transmitidas pela água causam hepatite aguda pelo vírus da hepatite A e pelos vírus da hepatite E, com mortalidade associada significativa especialmente em relação à hepatite E em gestantes. Protocolos reais de monitoramento da qualidade da água propostos para contextos humanitários foram projetados para manter bactérias como a E.Coli como um indicador de contaminação fecal. Mas já se sabe que não há correlação com outros microrganismos, como vírus que são mais resistentes a muitos processos de ativação.
Até agora, a detecção de vírus em ambientes de crise humanitária tem sido realizada adaptando protocolos existentes às condições desses contextos, e enviando amostras para laboratórios de referência para detecção molecular de vírus. Há necessidade de métodos para detectar patógenos virais e indicadores virais no ponto de vista para reduzir os riscos à saúde pública, prevenir surtos e aumentar a eficiência das intervenções humanitárias. Propomos um método para a detecção de vírus em amostras de água de 10 litros que é dividido em três etapas: concentração viral, extração de ácido nucleico e detecção viral.
Todas essas etapas foram adaptadas a partir de métodos atualmente em uso em nosso laboratório, e podem ser realizadas no ponto de vista utilizando reagentes e equipamentos portáteis, produzindo os dependentes de alimentação e freezers. Além disso, uma solução de conservante foi adicionada ao método para justificar a estabilidade dos ácidos nucleicos para envio aos laboratórios de referência, se necessário. O método que propomos se chama VirWaTest e foi desenvolvido com a colaboração da GenIUL e da Intermon Oxfam.
Antes de iniciar, o número de amostras a serem testadas deve ser considerado para a preparação de reagentes e material. Recomenda-se coletar duas réplicas de cada amostra de água para obter resultados representativos. Várias amostras podem ser testadas ao mesmo tempo se a quantidade apropriada de material estiver disponível.
Os reagentes e materiais devem ser preparados e embalados antes de serem movidos ou enviados para o local onde o método é necessário. A lista de materiais e pequenos equipamentos que devem ser embalados está descrita na tabela um. Prepare um estoque de bacteriófago MS2 a ser adicionado a cada amostra de água como controle de processo seguindo o método ISO correspondente.
Em seguida, distribua 10 microlitadores de uma suspensão contendo 10 a 10 unidades de plataforma pré-transformadas em tubos de 10 mL e deixe a água secar. Um tubo por amostra de água será necessário. Além disso, prepare um tubo contendo 10 mLs de água destilada estéril por amostra coletada.
Para a solução de leite desnatado pré-floculada, prepare um tubo contendo o leite desnatado, um saco plástico de zíper contendo o sal marinho e uma garrafa plástica contendo a água destilada. Para ajuste de pH, prepare um tubo contendo o ácido cítrico, um tubo contendo o hidróxido de sódio e dois recipientes plásticos com 25 e 50 mLs de água destilada. Para cada amostra de água a ser testada, prepare um sachê condicionante adicionando os sais do mar e o ácido cítrico a um saco plástico de zíper, e uma solução de preservação adicionando o tampão de lise, e conservante de ácido nucleico, a um tubo de 5 mL.
Por fim, prepare quatro sachês neutralizantes, adicionando detergente de potência a quatro sacos plásticos de zíper. Para cada amostra de água a ser extraída, prepare um tubo de cinco mL contendo partículas magnéticas e etanol, e três tubos de 2 mL contendo 500, 600 e 200 microliters de tampões de lavagem um, dois e três, respectivamente, e um tubo contendo tampão de eluição. Duas extrações diferentes de ácido nucleico podem ser analisadas simultaneamente em cada ensaio pcr se um termociclador Newell for usado.
Para todos os ensaios da PCR, prepare a água da biologia molecular. Prepare misturas contendo dois primers e uma prova específica para cada vírus alvo de acordo com os volumes e concentrações descritos no protocolo. Para cada vírus, adicione os volumes indicados em tubos de um a oito de uma bandeja de tubos.
Corte a tira, dividindo-a em duas tiras. Tubos de um a cinco e tubos de seis a oito. Para cada vírus, suspensões de DNA secos de ar contendo 10 a 5, 10 a 7 e 10 a 9 e cópias conhecidas pré-feitas em tubos seis, sete e oito.
Este protocolo de concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica pelo qual o baixo pH e a condição de alta condutividade leva as proteínas do leite desnatado a se organizarem em flocs que os vírus absorvem. Uma vez que os flocs são resolvidos, eles podem ser facilmente coletados. Colete uma amostra de água de 10 litros em um balde de fundo plano fornecido com uma tampa.
Se coletar de um cano, deixe a água correr por alguns segundos antes de coletar a água. É importante usar baldes claros para visualizar pelotas. Procure um espaço plano em um lugar fresco longe da luz solar direta Coloque um agitador magnético conectado a uma bateria sob o suporte do balde e coloque o balde contendo a amostra de água em cada suporte.
Reconsidere o ácido cítrico e o hidróxido de sódio e agite até que sejam completamente dissolvidos. Despeje 500 mLs de água destilada em um saco de stand-up e coloque o saco em um agitador magnético. Adicione o conteúdo de um sachê de sal marinho e o conteúdo de um tubo de leite desnatado e mexa por cinco minutos em velocidade média.
Ajuste o pH do leite desnatado floculado usando ácido cítrico e hidróxido de sódio a um pH entre 3,4 e 3,6. Desligue o agitador magnético e certifique-se de que os flocos estejam visíveis. Uma lanterna pode ajudar a visualizar os flocos.
Jogue um ímã de agitação na água. Coloque o agitador magnético na velocidade máxima e ligue-o. Adicione 10 mLs de água destilada a um tubo controlado pelo processo.
Inverta-o algumas vezes e despeje a solução na água. Despeje o conteúdo de uma amostra condicionando sachê na água e mexa por cinco minutos. Certifique-se de que o pH da amostra de água, que deve ser entre 3,4 e 3,6.
Ajuste o pH se necessário. Adicione 100 mLs de solução de leite desnatado pré-floculado, sele o balde com a tampa e deixe a água mexendo por oito horas em velocidade mínima. Depois de oito horas, desligue o agitador magnético e deixe os flocos se contentarem por pelo menos cinco horas extras.
Com um sistema baseado no uso de um controlador de pipeta, um tubo plástico e um par de pipetas, descarte o supernasciente, tomando cuidado para não perturbar os flocos no fundo do balde. Quando o nível da água estiver prestes a atingir o ímã de agitação, aperte o tubo de plástico para parar o fluxo de água e afaste a pipeta do balde. Agite o balde para resuspensar os flocs e despejá-los em um saco plástico stand-up.
Deixe os flocs se contentarem com uma hora extra. Aspire cuidadosamente a água sobrenatante usando uma pipeta evitando perturbar os flocos. Aspire os flocs usando uma pipeta e transfira-os para um tubo cônico.
Observe o volume final do concentrado amostral e transfira 1 mL para um tubo contendo a solução conservante. A suspensão pode ser usada para realizar a extração de ácido nucleico no campo, ou enviar para um laboratório de referência para análise posterior. A água descartada durante a coleta dos flocos deve ser tratada antes do descarte.
Adicione o conteúdo de um sachê de agente neutralizante ao balde contendo a água descartada. Misture a água e deixe-a parada por trinta minutos. Em seguida, descarte a água tratada como lixo geral.
As partículas magnéticas podem ser transferidas de um tubo para outro usando uma pipeta magnética. Acostume-se com o funcionamento de uma pipeta magnética antes de realizar a extração. Disponha os tubos que contenham o reagente necessário para extração em um rack.
Ou seja, da esquerda para a direita: tampão de ligação, buffers de lavagem e tampão de eluição. Transfira 1 mL de concentrado amostral para o tubo contendo o tampão de ligação usando uma pipeta de plástico descartável. Inverta o tubo dez vezes para otimizar a solução.
Incubar a solução à temperatura ambiente por dez minutos enquanto mistura continuamente usando um orbital solo ou manualmente. Colete as partículas magnéticas usando uma pipeta magnética e uma ponta limpa que pode ser reutilizada para os três tampões de lavagem e solte as partículas magnéticas no tubo contendo tampão de lavagem um. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por trinta segundos e colete-as.
Repita este procedimento de lavagem para lavar tampões dois e três. Colete as partículas magnéticas na lavagem do tampão três e solte-as no tubo contendo o tampão de elução. Em seguida, descarte a ponta.
Incubar a solução à temperatura ambiente por cinco minutos enquanto se mistura continuamente usando o orbital solo. Substitua a ponta da pipeta magnética por qualquer uma e colete todas as partículas magnéticas do tampão de eluição. Descarte a ponta com as partículas presas.
O ácido nucleico permanece no tampão de elução, que deve ser armazenado para análise ou envio posterior. Use uma tira de cinco tubos e uma de três tubos preparada para detectar adenovírus humanos. Adicione água, mistura de PCR e extração de ácido nucleico aos tubos de um a cinco, de acordo com o protocolo.
Depois, adicione água e mistura PCR aos tubos de seis a oito. Coloque ambas as tiras no termociclador e selecione a execução apropriada. Uma vez concluída a execução, colete os resultados e analise os dados obtidos.
Somente quando os testes virais resultaram em negativo, a detecção de MS2 deve ser realizada. Use tiras de tubo preparadas para detecção de MS2 e selecione o perfil térmico apropriado para o PCR. A extração de ácido nucleico magnético VirWaTest foi comparada ao QIAgen viral RNA, imitado por testar amostras de água cravadas com adenovírus humanos e MS2.
O valor p do teste de redução mostra recuperações virais significativamente maiores usando o VirWaTest do que o QiAgen como um método de extração para ambos os vírus testados. O método desenvolvido para concentração viral foi testado no campo com a colaboração de equipes de lavagem da Oxfam localizadas em Bangui, República Centro-Africana e em Pedernales, Equador, que coletaram amostras de água, concentraram-nas aplicando o método de concentração desenvolvido, e as enviaram ao laboratório em Barcelona para extração nucleica de ácido e quantificação viral. No Equador, os adenovírus humanos foram detectados em todas as amostras testadas, enquanto uma em cada cinco amostras coletadas e concentradas em Bangui deu positivo para adenovírus humanos.
O método desenvolvido mostrou-se útil quando foi avaliado por equipes de lavagem da Oxfam Intermon em Bangui, República Centro-Africana e por outra equipe em Pedernales, Equador. O VirWaTest pode fazer parte de um sistema de alerta antecipado ou pode ser usado em investigação de surtos por organizações envolvidas em saneamento de água. Este equipamento facilita a análise de patógenos virais na água e a melhoria do manejo da segurança hídrica com o objetivo de reduzir incidentes de doenças virais em contextos de crise humanitária.
