Физиологически нетронутыми мыши скелетной мышцы может производить высокое качество рентгеновской дифракции моделей, содержащих много структурной информации, которая может обеспечить понимание физиологических процессов. Рентгеновская дифракция является единственным методом, который позволяет получать структурную информацию высокого разрешения из живой мышечной ткани в реальных физиологических условиях в режиме реального физиологического времени. Многие мышечные заболевания наследуются.
С увеличением доступности для генетически модифицировать большинство моделей миопатии, рентгеновская дифракция может обеспечить структурное понимание механизмов заболевания и указать терапевтические стратегии. Большинство extensor digitorum longus и soleus мышц особенно удобны для этой цели. Но многие другие мышцы у мелких животных могут быть вскрыты нетронутыми и обрабатываются аналогичным образом.
Перед началом процедуры включите комбинированный двигательный предуктор, контроллер превратно-двигательной силы с стимулятором бифазного тока высокой мощности и системой управления данными управления компьютером. Затем распылите кожу на заднюю конечность мыши с помощью холодного раствора Ringer и используйте тонкие ножницы для рассечения кожи вокруг бедра. Используя пять типсов, быстро потяните кожу вниз, чтобы разоблачить мышцы и ампутировать заднюю конечность.
Поместите конечность в еластомер покрытием рассечения блюдо, содержащее кислородом раствор Ringer и поместите блюдо под бинокль рассечения микроскопа. Чтобы собрать мышцу подошвы, прикрепите заднюю конечность с мышцей гастрочнемиуса лицом вверх. Используйте тонкие ножницы, чтобы сократить дистальное сухожилие группы мышц gastrocnemius/soleus.
Отрежьте фасции по обе стороны от мышцы гастрокнейма, чтобы мышцы были подняты мягко и медленно от кости. Затем освободите проксимальное сухожилие подошвы мышцы. Прикрепите группу мышц, содержащую мышцы гастрокнейма и дистальное сухожилие в блюде.
Поднимите мышцу подошвы осторожно через проксимальное сухожилие, чтобы отделить его от мышцы гастрокнеймия, оставляя как можно больше подошвы дистального сухожилия нетронутыми, как это возможно. Для сбора extensor digitorum longus или EDL мышцы, контактный заднюю конечность в блюдо с голени передней мышцы лицом вверх и сократить фасции вдоль передней мышцы голени. Используйте типсы, чтобы вытащить фасции ясно и сократить дистальное сухожилие голени передней мышцы.
Поднимите переднюю мышцу голени и вырезать его тщательно, не потянув на мышцу ЭДЛ, и разрезать боковую сторону колена, чтобы разоблачить два сухожилия. Вырезать проксимальное сухожилие, оставив нам большую часть сухожилия, как это возможно еще прилагается к мышце и осторожно тянуть на сухожилие, чтобы поднять мышцы ЭДЛ. Затем вырезать дистальное сухожилие, как только он подвергается.
Чтобы смонтировать собранные мышцы, приколоть мышцы через сухожилия и обрезать как можно больше лишнего жира, фасции и сухожилий, как это возможно. Вставьте одно сухожилие в предварительно завязанный узел и используйте шов, связывающий типсы, чтобы плотно завязать шов. Свяжите второй узел вокруг металлического крючка и повторите процедуру на другом конце сухожилия.
Затем прикрепите короткий крюк к нижней части экспериментальной камеры, а длинный крюк к двухмоторной силе предуцатора двигателя. Пузырь раствора в экспериментальной камере со 100%-ным кислородом. Для оптимизации протокола стимуляции и длины мышц настроить микро-манипуляторов, прикрепленных к двигательу преобразователя для создания базового напряжения между 15 до 20 millinewtons, чтобы найти лучшие параметры стимула для растяжения мышц.
Установите напряжение стимуляции до 40 вольт. Ток стимуляции будет систематически увеличиваться до тех пор, пока не будет дополнительного увеличения силы подергивания. Чтобы найти оптимальную длину, увеличить длину мышц и активировать мышцы с одного дергаться, пока активная сила перестает увеличиваться.
Выполните одну секунду тетаничное сокращение, чтобы проверить монтаж и растянуть мышцы обратно к оптимальной базовой силы по мере необходимости. Затем записывают длину мышц в миллиметрах с помощью цифрового калипера. Чтобы определить положение луча, используйте кусок рентгеновской чувствительной бумаги, которая производит темное пятно в ответ на рентгеновские лучи и видео перекрестие генератора для создания перекрестия выровнены с ожогом знак на бумаге.
Используя графический пользовательский интерфейс BioCAT к позиционеру образца, центр мышцы на позиции луча и переместить этап образца, чтобы колебаться образец камеры на 10 до 20 миллиметров в секунду, чтобы распространить дозу рентгеновского излучения по всей мышце во время воздействия. Наблюдайте образец по мере того как он двигает для того чтобы во избежание большие зоны фасции которые содержат коллаген и обеспечить что он остается освещенным во время всего следа своего перемещения. Вооружим детектор и ждите триггера от системы сбора данных.
Затем запустите механические и рентгеновские данные одновременно для их синхронизации. Рентгеновские модели будут собираться непрерывно на протяжении всего протокола с 10-миллисекундной экспозицией и 50-миллисекундный период экспозиции. В этом репрезентативном изометрическом тетаном сокращении мышца ЭДЛ удерживалась в состоянии покоя в течение 0,5 секунд, прежде чем она была активирована в течение одной секунды, а затем 1,5-секундная релаксация.
Структура рентгеновской дифракции мышц может дать нанометровому разрешению структурную информацию из структур внутри саркомера. Миозин основе слоя линий, содержащих толстые нити являются сильными и острыми в узорах от отдыха мышц, в то время как актин основе слоя линий, содержащих тонкие нити являются более заметными в шаблонах от сокращение мышц. Различия, полученные путем вычитания отдыха картины из модели заражения может пролить свет на структурные изменения во время развития силы в здоровой и больной мышцы.
Следуя этим структурным изменениям на миллисекундной шкале молекулярных событий во время сокращения мышц и релаксации, рентгеновские дифракционные модели могут выявить существенную структурную информацию. В этом репрезентативном экваториальном анализе отражений с использованием экватора рутины в пакете MuscleX с открытым исходным кодом, экваториальное соотношение интенсивности указывает на близость миозина к действию в мышцах покоя и тесно коррелирует с количеством прикрепленных поперечных мостов в контрактной мышце murine skeletal. Расстояние между двумя отражениями 1,0 обратно связано с расстоянием между ними.
Чистое вскрытие является ключом для успешного неповрежденного эксперимента по рентгеновскому снимку мышц, поэтому старайтесь избегать механических повреждений во время подготовки мышц. Любой стандартный физиологический протокол с целыми мышцами может быть реализован в этих экспериментах и может быть использован для изучения мышечной активации, релаксации и кросс-бридж поведение во время быстрой механической быстротекости. Генетические манипуляции с мышами становятся все более изощренными.
Новые трансгенные модели мыши позволят более конкретные и глубокие эксперименты, которые будут разработаны, чтобы указать новые терапевтические направления для человека миопатии.
