生理学的に無傷のマウス骨格筋は、生理学的プロセスに関する洞察を提供することができる多くの構造情報を含む高品質のX線回折パターンを生成することができます。X線回折は、実際の生理学的な時間で生きている筋肉組織から高解像度の構造情報を取得することを可能にする唯一の技術です。多くの筋肉疾患が遺伝する。
ほとんどのモデルのミオパシーを遺伝的に改変する可用性が高まるにつれて、X線回折は疾患メカニズムの構造的洞察を提供し、治療戦略を示すことができる。ほとんどの伸長体の長さとソレウスの筋肉は、この目的のために特に便利です。しかし、小動物の他の多くの筋肉はそのまま解剖され、同様の方法で処理することができます。
手順を開始する前に、複合モータ力トランスデューサ、高出力二相電流刺激装置を備えたモータ力トランスデューサコントローラ、およびコンピュータ制御データ取得制御システムをオンにします。次に、マウスの後肢の皮膚に冷たいリンガーの溶液をスプレーし、細かい解剖ハサミを使用して太ももの周りの皮膚を切断します。5番鉗子を使用して、すぐに皮膚を引き下げて筋肉を露出させ、後肢を切断する。
酸素化リンガー溶液を含むエラストマーコーティングの解剖皿に四肢を入れ、双眼鏡解剖顕微鏡の下に皿を置きます。ソレウスの筋肉を収穫するには、後肢を胃腸筋を上向きにピン留めします。細かいはさみを使用して、胃内膜/ソレウス筋群の遠位腱を切断します。
胃頭筋の両側の筋膜を切り取り、筋肉を骨からゆっくりと離します。その後、ソレウスの筋肉の近位腱を解放します。胃腸筋と皿の遠位腱を含む筋肉群をピン留めします。
近位腱を介してソレウスの筋肉を穏やかに持ち上げて胃内腕筋から分離し、できるだけ多くのソレウス遠位腱をそのまま残します。伸長体長根またはEDL筋肉を収穫するには、チビアリス前筋を上向きにして皿の中で後肢を固定し、脛骨前筋に沿って筋膜を切断する。筋膜をはっきりと引っ張り、脛表前筋の遠位腱を切断するために鉗子を使用してください。
脛指筋を持ち上げ、EDL筋肉を引っ張らずに慎重に切り取り、膝の側面を切り開いて2つの腱を露出させる。近位腱を切り、できるだけ多くの腱を筋肉に取り付け、腱を優しく引っ張ってEDL筋肉を持ち上げます。その後、遠位腱が露出したら切断します。
収穫された筋肉をマウントするには、腱を介して筋肉をピン留めし、余分な脂肪、筋膜および腱のできるだけ多くをトリミングします。1つの腱を事前に結ばれた結び目に挿入し、縫合糸結束をしっかりと結ぶために縫合線結束を使用します。金属フックの周りに2番目の結び目を結び、腱のもう一方の端に手順を繰り返します。
次に、実験室の底部に短フックを取り付け、長いフックをデュアルモード力トランスデューサモーターに取り付けます。100%酸素で実験室で溶液を泡立て。刺激プロトコルと筋肉の長さを最適化するには、トランスデューサモーターに取り付けられたマイクロマニピュレータを調整して、15〜20ミリニュートン間のベースライン張力を生成し、筋肉を伸ばす最良の刺激パラメータを見つけます。
刺激電圧を40ボルトに設定します。刺激電流は、刺激力の増加がなくなるまで体系的に増加します。最適な長さを見つけるには、筋肉の長さを増やし、アクティブな力が増加しなくなるまで単一のツイッチで筋肉を活性化します。
1秒間のテタニック収縮を行い、取り付けをテストし、必要に応じて筋肉を最適なベースライン力まで伸ばします。次に、筋肉の長さをデジタルキャリパーでミリメートル単位で記録します。ビーム位置を決定するには、X線に応答して暗いスポットを生成する X 線に敏感な紙を使用し、ビデオクロスヘア ジェネレーターを使用して、紙の上のバーン マークに合わせて十字線を作成します。
BioCAT が提供するグラフィカル ユーザー インターフェイスをサンプル ポジショナーに使用し、ビーム位置に筋肉を中央に置き、サンプル ステージを移動してサンプルチャンバーを毎秒 10 ~ 20 ミリメートルで振動させ、X 線量を筋肉全体に広げます。サンプルが動く際に、コラーゲンを含む鼻隠しの大きな領域を避け、移動経路全体で照らされたままになるように観察します。検出器をアームし、データ取得システムからのトリガーを待ちます。
次に、機械データとX線データを同時にトリガして同期させます。X線パターンは、10ミリ秒の露光時間と50ミリ秒の露光期間で、プロトコル全体で継続的に収集されます。この代表アイソメトリックテタニック収縮では、EDL筋肉は1秒間活性化される前に0.5秒間休息中に保持され、続いて1.5秒の弛緩が続いた。
筋肉X線回折パターンは、サルコメア内の構造からナノメートル解像度の構造情報を与えることができます。太いフィラメントを含むミオシンベースの層線は、安静時の筋肉からのパターンでは強く鋭く、薄いフィラメントを含むアクチンベースの層線は収縮する筋肉からのパターンでより顕著である。収縮パターンから静止パターンを差し引くことによって得られる差分パターンは、健康で病気の筋肉の力の発達中に構造変化に光を当てることができます。
筋肉収縮および弛緩の間の分子事象のミリ秒のタイムスケールでこれらの構造変化に従うことによって、X線回折パターンは、実質的な構造情報を明らかにすることができる。この代表的な赤道反射解析では、オープンソースMuscleXパッケージにおける赤道ルーチンを用いて、赤道強度比は、縮れた筋肉におけるミオシンの近接性を示し、収縮するマウス骨格筋に付着した架橋の数と密接に相関している。2つの1,0反射の間の距離は、インターフィラメント間隔と逆に関係している。
クリーン解剖は、正常な無傷の筋肉X線実験のための鍵ですので、筋肉の準備中に任意の機械的な損傷を避けるようにしてください。筋肉全体を伴う標準的な生理学的プロトコルは、これらの実験で実施することができ、急速な機械的一過性の間に筋肉の活性化、リラクゼーションおよびクロスブリッジ行動を研究するために使用することができる。マウスの遺伝子操作はますます高度化しています。
新しいトランスジェニックマウスモデルは、ヒトミオパチーの新しい治療方向を示すように、より具体的で洞察力のある実験を可能にする。
