Этот протокол может помочь ученому, заинтересованного в нелинейной микроскопии, понять ключевые компоненты, настройку и процедуру выравнивания микроскопа на основе стимулировало рассеяние Романа. Основными преимуществами микроскопии SRS являются его способности выполнять безмекатье изображения на основе колебательного контраста и получить изображение в течение нескольких секунд. SRS микроскопия приняла этикетки свободной визуализации на новые высоты, особенно исследования сложных биологических структур, таких как липиды, которые имеют основополагающее значение для клеток и клеточной архитектуры.
Сигнал SRS обнаруживается как небольшое изменение интенсивности пучка зонда и может быть поврежден шумом. Поэтому точный знак имеет решающее значение. Для начала выровняйте лазерные лучи OPO и Титан-сапфир, чтобы они оба достигли микроскопа.
Затем поместите детекторы датчика положения лазерного луча в два положения между дихроическим зеркалом один и зеркало шесть. Первая позиция расположена близко к дихроическому зеркалу, вторая близка к зеркалу шесть. Для каждой позиции используйте датчики для обнаружения координат X и Y луча OPO.
Важно, убедитесь, что X и Y координаты титан-сапфирового лазерного луча имеют одинаковую OPO в обоих положениях детекторов датчика. Если в некоторых положениях координаты не совпадают, настройте наклон соседнего зеркала, чтобы компенсировать. Следуйте этой же процедуре, чтобы выровнять титаново-сапфировый луч позиции по отношению к OPO для пути между зеркалом шесть и семь.
Установите дополнительное зеркало на флип-флоп горе между зеркалом шесть и семь и перевернуть крепление зеркала, чтобы направить луч в автокоррелятор. Питание на контроллере автокоррелатора, запустите программное приложение на компьютере, контролируя его, и установите винт регулировки расстояния луча автокоррелатора в нормальное положение на 8,35 миллиметра. Затем остановите титаново-сапфировый луч и отпустите и проецируйте луч OPO от дополнительного зеркала к входному зеркалу автокоррелятора.
Попробуйте настроить входное зеркало, чтобы максимизировать лазерный импульсный сигнал, как показано здесь. Затем остановите луч OPO и отпустите и проецируйте титаново-сапфировый луч от установленного на флип-флопе зеркала к входному зеркалу и в автокоррелатор. Повторите оптимальную регулировку луча до тех пор, пока не будет получен сигнал автокоррелатора, показанный здесь.
Теперь установите винт регулировки расстояния луча к перекрестному положению на 7.30 миллиметрах. Отпустите оба луча и сканируйте отложенную линию, чтобы перекрывать два луча. Получить полученный кросс-корреляторный сигнал, как показано здесь.
Затем переверните смонтированное зеркало флип-флопа так, чтобы лучи могли достигать зеркала семь и головы сканирования микроскопа. Удалите конденсатор и используйте кнопку побега, чтобы временно снять 60x субъективный объектив. Затем поверните нос кусок для перемещения 60x субъективный объектив от оптического пути.
Затем крепление детектора к верхней части микроскопа с помощью внешнего механического крепления. Подключите выход детектора через фильтр низкого прохода 50 Ohm к осциллоскопу. Теперь включите процессор, который управляет головой сканера и проецирует луч OPO в головную часть сканера микроскопа.
Мониторинг сигнала OPO и максимизация мощности, измеренной детектором с помощью переводчика XY. Затем переключитесь луч с лазера OPO на титаново-сапфировый лазер и убедитесь, что сигнал также получен для титан-сапфирового лазера. Это указывает на то, что оба луча хорошо выровнены.
Завершите выравнивание пучка, вращая назад нос кусок ввести 60x субъективным. Затем используйте кнопку переориентации на микроскоп, чтобы восстановить завершенный фокус на объектив 60x микроскопа. Наконец, поместите цель, с увеличением 40x, вместо конденсатор, не касаясь или нарушая образец.
Установите мощность титаново-сапфировых и OPO лазеров, измеренных перед микроскопом, до 30 милливатт для обоих лучей. Затем установите длину волны лазера OPO на другое значение, по отношению к предыдущему, так что насос и зонд не находятся в резонансе с колебательной частотой бисера. Затем отпустите оба луча, чтобы они вошли в микроскоп.
Запустите компьютеризированную линию задержки сканирования и заместите измеренную интенсивность с помощью усилителя блокировки для каждой позиции линии задержки. Подождите, пока сканирование линии задержки не будет завершено. Теперь установите длину волны OPO обратно в 1076 нанометров, так что насос и зонд находятся в резонансе с колебательной частотой бисера.
Выполнить линию задержки сканирования компьютеризированным переводчиком и ждать, пока сканирование линии задержки не будет завершено. Наконец, установите полученное положение луча перекрытия и линию задержки для следующего приобретения стимулируемых изображений рассеяния Рамана. Для оптимизации пространственной синхронизации балок начните с остановки титаново-сапфирового луча и снижения мощности OPO до восьми милливатт.
Затем подключите считывание детектора к карте получения данных. Запустите программу сбора данных вместе с консолью сканирования микроскопа. После завершения, сохранить файл и обработать данные, чтобы получить изображение, как показано здесь.
Затем остановите пучок OPO и уменьшите мощность титан-сапфира до 2,5-4,5 милливатт. Подключите детектор с усилителем блокировки и его считывания с картой сбора данных. Затем снова запустите программу сбора данных вместе с консолью сканирования микроскопа.
После завершения, сохранить файл и обработать данные, чтобы получить изображение, как показано здесь. Ввести стопку фильтров между 40x цели и фотодиод, чтобы удалить импульсы насоса и приобрести только сигнал топить. Затем установите сигнал насоса до 810 нанометров с сфокусированной мощностью восемь милливатт.
Установите сигнал зонда до 1076 нанометров с той же фокусировкой мощности в восемь милливатт, чтобы исследовать типичную углеродно-водородную связь полистирола с раманский сдвиг 3054 обратных сантиметров. Подключите детектор с усилителем блокировки и считыванием усилителя блокировки к карте получения данных. Наконец, установите формат пикселей и время приобретения в программе микроскопа и запустите его и систему сбора данных, сохранив матричный файл после его завершения.
Пример измерения из одной точки образца отображается здесь. Когда луч не перекрывается во времени или пространстве, полученный результат от резонанса, где амплитуда сигнала, измеряемая усилителем блокировки, равна нулю. Фаза этого сигнала, однако, прыгает между отрицательными и положительными значениями.
Если лучи перекрываются в пространстве, сигнал увеличивается и достигает своего максимума, когда лучи прекрасно перекрываются во времени, в то время как фаза начинает достигать фиксированного значения в то время, когда лучи перекрываются. На изображении передачи используется один луч, а интенсивность передаваемого луча из образца измеряется фотодиодом. Слева изображение передачи было получено с помощью OPO, а справа изображение передачи было получено с помощью титана-сапфира.
Типичный пример изображения SRS показан здесь, в котором без этикетки изображения полистирола бусы диаметром три микрометра сообщили. Для получения высококачественного изображения, основанного на микроскопии SRS, выравнивание микроскопа имеет решающее значение. Поэтому все указанные этапы в протоколе должны быть выполнены тщательно.
