Визуализация in vivo биологических тканей с субклеточным разрешением и химической специфичностью является мощным инструментом для понимания динамических процессов, участвующих в клеточном метаболизме, иммунном ответе и ремоделировании тканей. С помощью комбинированной двухфотонной флуоресценции и стимулированной рамановской рассеянной микроскопии критическая биохимическая и биофизическая информация биологических тканей может быть получена с нескольких точек зрения с субклеточным разрешением. В частности, эта двухмодальная микроскопия может быть использована для изображения клеточной динамики и взаимодействий в спинном мозге мыши для изучения прогрессирования нейродегенеративных заболеваний и травм спинного мозга.
Для начала включите титановый сапфировый лазер, переключив переключатель клавиши из положения ожидания в положение и подождите 30 минут, пока лазер прогреется. Затем включите OPO, нажав кнопку «Пуск» на панели управления OPO, и подождите 20 минут, пока лазер прогреется. После того, как пикосекундный лазер прогреется, проверьте глубину модуляции луча Стокса, снизив мощность луча Стокса примерно до 20 милливатт, открыв лазерный затвор для луча Стокса и разместив высокоскоростной фотодетектор на выходе OPO для обнаружения луча.
Затем подключите выходной порт фотоприемника к входному порту осциллографа с помощью коаксиального кабеля с разъемом BNC для мониторинга лазерного импульса. Затем откройте окно управления EOM в программном обеспечении управления OPO и отрегулируйте мощность и фазу EOM в соответствии с диаграммой интенсивности импульсов, показанной на осциллографе, для достижения максимальной глубины модуляции на 20 мегагерц. В программном обеспечении управления OPO откройте лазерный затвор накачки, остановив выход Stokes.
Затем щелкните поле заданного сигнала, чтобы установить длину волны пучка насоса на 796 нанометров, затем щелкните установленный блок питания OPO и введите 20, чтобы установить его мощность до минимума для оптического выравнивания. Затем поместите выравнивание пластины P1 за поляризационным делителем пучка примерно на 10 сантиметров и поместите пластину P2 позади P1 примерно на 30 сантиметров на оптическом пути. После открытия затвора микроскопа для пикосекундного лазерного луча отрегулируйте зеркало M1, чтобы найти пикосекундный центр лазерного луча в сквозном отверстии P1. Используйте инфракрасный прицел для наблюдения за положением точки луча на P1 при регулировке зеркала M1. Аналогичным образом, отрегулируйте зеркало M2, чтобы найти пикосекундный центр лазерного луча в сквозном отверстии P2. Используйте инфракрасный прицел для наблюдения за положением точки луча на P2 при регулировке зеркала M2. После регулировки зеркал до тех пор, пока центр пикосекундного луча не расположится в сквозном отверстии обеих пластин выравнивания, закройте затвор пикосекундного луча в программном обеспечении управления микроскопом.
Далее откройте затвор микроскопа для фемтосекундного лазерного луча. Отрегулируйте зеркало M3, чтобы найти центр пятна фемтосекундного лазерного луча в сквозном отверстии P1, затем отрегулируйте зеркало M4, чтобы найти центр пятна фемтосекундного лазерного луча в сквозном отверстии P2. После регулировки зеркал до тех пор, пока фемтосекундный центр лазерного луча не расположится в сквозных отверстиях двух пластин выравнивания, закройте затвор микроскопа для фемтосекундного луча. Затем поместите камеру в положение объектива, чтобы визуализировать расположение двух лучевых пятен и отметить положение пучка насоса на экране камеры в качестве ориентира.
Затем поместите выравнивающую пластину P0 перед объективом L3 и отрегулируйте оптическую зеркальную с помощью шестигранного ключа так, чтобы центр луча Стокса проходил сквозное отверстие пластины выравнивания в выходном порту лазера. Используйте инфракрасный прицел для подтверждения положения пятна луча на P0 во время регулировки. Затем снимите выравнивающую пластину P0 и используйте шестигранную клавишу для регулировки двух оптических зеркал таким образом, чтобы центр луча Стокса солидаризировался с опорной отметкой пучка насоса на камере.
Продолжайте регулировать зеркала до тех пор, пока луч Стокса не будет строго перекрываться с пучком насоса как в плоскостях P0, так и в плоскостях камеры. Откройте программное обеспечение управления блокирующим усилителем и установите длину волны лазера накачки на 796 нанометров, а мощность насоса и пучка Стокса на 50 и 70 милливатт, соответствующих 15 и 25 милливаттам на образце соответственно. Затем используйте оливковое масло для оптимизации фазы усилителя.
Оливковое масло запечатано в слайд с папиросной бумагой, прикрепленной к дну, чтобы усилить обратное рассеяние сигнала или обнаружение EPI-SRS. Поместите образец оливкового масла на сцену и отрегулируйте фокус объектива 25X на образец. Используя программное обеспечение для управления микроскопом, установите параметры визуализации, как указано в текстовой рукописи.
Затем, используя программное обеспечение для управления блокирующим усилителем, установите значение постоянной времени равным 10 микросекундам. Далее сканируем лазерный луч над образцом, настраивая фазу с размером шага 22,5 градуса до тех пор, пока интенсивность сигнала SRS не достигнет максимума. Затем сканируйте образец с закрытым лазерным затвором, настраивая значение смещения с размером шага в один милливольт до тех пор, пока средний сигнал SRS не будет близок к нулю.
Затем откройте диалоговое окно менеджера задержек в программном обеспечении управления OPO и отсканируйте оливковое масло, настроив стадию задержки до тех пор, пока сигнал SRS оливкового масла не достигнет своего максимума. Затем остановите сканирование и нажмите кнопку добавления данных в диалоговом окне диспетчера задержек, чтобы записать текущие данные о задержке. После аналогичного получения данных о задержке при различных рамановских сдвигах путем визуализации различных химических образцов выберите данные в порядке пять в диалоговом окне диспетчера задержки, чтобы соответствовать текущим точкам данных с полиномической функцией пятого порядка.
Затем примените подходящие данные, нажав на кнопку «Использовать в качестве пользовательского» и установив флажок. Стадия задержки автоматически регулируется на разных длинах волн в соответствии с установленной кривой задержки. Для визуализации in vivo зафиксируйте мышь на стадии стабилизации с обнажением спинного мозга и погружением в физиологический раствор.
Теперь установите стабилизационную ступень на пятиосевой ступени под микроскопом TPEF-SRS. Затем закрепите голову мыши двумя стойками головы и опустите удерживающую пластину, чтобы обеспечить достаточно места для движения грудной клетки во время дыхания, облегчая артефакты движения. Затем отрегулируйте Z-трансляционную стадию, чтобы настроить фокус до тех пор, пока изображение Брайтфилда сосудистой системы спинного мозга не будет наблюдаться под объективом 10X.
Найдите спинную вену спинного мозга в центре поля зрения, настроив двухосевую трансляционную стадию пятиосевой стадии. Затем настройте углы крена и тангажа пятиосевой ступени, чтобы отрегулировать спинную поверхность спинного мозга перпендикулярно оси цели на основе изображения Брайтфилда. Затем замените 10X на объектив погружения в воду 25X для визуализации TPEF-SRS.
Для изображения SRS выберите поляризационный разветвитель луча над объективом, нажав кнопку переключателя, подключенную к моторизованному флипперу. Для получения изображений TPEF выберите дихроичное зеркало D2 над объективом, нажав кнопку переключателя, подключенную к моторизованному флипперу. Наконец, установите параметры изображения, как описано в текстовой рукописи, и начните сканирование образца.
Двойная визуализация in vivo редко меченых аксонов YFP и миелиновых оболочек в спинном мозге мыши показала, что аксоны плотно обернуты толстым слоем миелиновых оболочек. Как видно на изображении спинного мозга TPEF-SRS, узлы Ранвье имеют уменьшенный аксональный диаметр и аксилемма непосредственно подвергается воздействию внеклеточного матрикса. В сочетании с новыми зондами для флуоресценции и визуализации SRS двухфотонная возбужденная флуоресцентная микроскопия SRS может обеспечить одновременную структурную и функциональную визуализацию различных биомолекул, облегчая наше понимание сложных биологических процессов.
