Белково-белковое взаимодействие в транскрипции традиционно изучалось с помощью por dialysis. Тем не менее, Por диализ чисто количественные. Мы используем интерферометрию биослоя, или BLI, чтобы преодолеть эту проблему.
По сравнению с Por dan, BLI обнаруживает связь в реальном времени и диссоциацию между партнерами по склеиванию. Он также генерирует количественные кинетические параметры, которые свидетельствуют о механизмах взаимодействия. Технология BLI может показаться пугающей, но это не трудно научиться использовать эту технологию, нужно иметь доступ к инструменту BLI и связанного с ним программного обеспечения.
Это видео позволит вам легко адаптироваться к технологии BLI. Приблизительно за 10 минут до начала анализа, пипетка 200 микролитров буфера BLI в трубку ПЦР. Удалите биосенсор никеля NTA из оригинальной упаковки, удерживая большую часть биосенсора с помощью руки в перчатках.
Поместите биосенсор над трубкой ПЦР таким образом, чтобы только стеклянный кончик биосенсора был погружен в буфер BLI. Держите наконечник биосенсора погруженным, по крайней мере, в течение 10 минут, чтобы обеспечить полную гидратацию. Включите машину Блиц.
Убедитесь, что машина подключена к компьютеру через порт вывода данных USB в задней части машины. На компьютере откройте связанное программное обеспечение и нажмите на Advanced Kinetics на левой стороне экрана. В программном обеспечении навеять всю соответствующую информацию об эксперименте под каждым соответствующим заголовком.
Нажмите на Biosensor Type и выберите Nickel NTA из меню высадки. Продолжительность каждого шага может быть изменена по умолчанию по мере необходимости. Для достижения оптимальных результатов используйте минимум 30 секунд для начального базового и базового уровня и 120 секунд для ассоциации и диссоциации.
Удалите гидратированный биосенсор никеля NTA из трубки ПЦР и прикрепите его к биосенсорной установке на машине, сдвинув широкую часть биосенсора на гору. Поместите 0,5 миллилитровую черную трубку микроцентрифуга в держатель трубки машины и пипетку 400 микролитров буфера BLI в нее. Закройте крышку машины таким образом, чтобы наконечник биосенсора погрузился в буфер в микроцентрифугной трубке.
Нажмите Далее на программное обеспечение, чтобы начать запись начальной базовой линии. После завершения первоначального базового этапа откройте крышку машины. Перемести ползунок вправо, чтобы держатель капли располагался перед черной стрелкой.
Pipette четыре микролитера из dialyzed его помечены лиганд на держатель капли и закрыть крышку машины, которая автоматически начнет запись загрузки шаг. После завершения загрузки откройте крышку машины. Перемести ползунок влево, чтобы держатель трубки снова располагался перед черной стрелкой.
Закройте крышку машины и убедитесь, что наконечник биосенсора погружается в буфер BLI трубки в держателе трубки. Машина и программное обеспечение автоматически начнут записывать базовый шаг. После того, как базовый шаг закончил запись, откройте крышку машины.
Удалите держатель капли и очистить его, высовывав любой белок и полоскания его двойной деионизированной водой в общей сложности пять раз. Используйте салфетку для очистки поверхности держателя капли после последней стирки. Замените держатель падения обратно на машину.
Перемести ползунок на машину вправо, так что держатель капли снова расположен перед черной стрелкой. Pipette четыре микролитров диасета на держатель капли и закрыть крышку машины, которая автоматически начнет запись ассоциации шаг. После того, как ассоциация шаг закончил запись, откройте крышку машины.
Переместите ползунок на машину вправо, чтобы держатель трубки снова располагался перед черной стрелкой и закроет крышку машины, которая автоматически начнет записывать шаг диссоциации. После того, как шаг диссоциации закончил запись, откройте крышку машины и удалите держатель капли и держатель трубки. Тщательно промойте оба с двойной деионизированной водой, чтобы смыть любой белок.
Удалите биосенсор и отбросьте его безопасно. Повторите эти шаги для одной и той же пары аналитов лиганда, используя различные концентрации аналитов. После завершения всех запусков сохраните данные по программному обеспечению, нажав на файл и сохраните эксперимент как на левой стороне экрана.
Под заголовком Run Data выберите исправление шага и установку один к одному и нажмите Анализ для генерации кинетических данных. Чтобы извлечь количественные данные в лист и создать графики, нажмите на Export to CSV и сохраните записанные данные в качестве файла CSV. Откройте файл CSV с помощью программного обеспечения электронной таблицы.
Полная длина GrgA состоит из 288 аминокислот. Как показано здесь, 28 аминокислот средней области связывает Sigma 28 непосредственно. Здесь средний регион помечены с конца терминала Его-тег был использован в качестве лиганда, который был впервые обездвижен до кончика никеля NTA биосенсора.
Показаны записи экспериментов с тремя различными концентрациями аналита, каждая из которых начинается за 30 секунд до связывания лиганда и заканчивается через две минуты после начала последней стирки. Улучшенная визуализация ассоциации лигандов и диссоциации показана после удаления значений на первых двух этапах и сброса базовой линии. После мытья unbound и терминала Его помечены GrgA 138 до 165 от биосенсора, в режиме реального времени связь с аналитом была записана после добавления Sigma 28.
Наконец, в режиме реального времени диссоциация была записана после мытья. Перед анализом BLI глицерол удаляется из лигандов и анализов. Мы рекомендуем, чтобы BLI проводился вскоре после диализа, как это обсуждается в тексте.
После характеристики белково-белковых взаимодействий в транскрипции с BLI, можно исследовать, как взаимодействие влияет на начало транскрипции, удлинение, и или прекращение.
