Только связывающие белки контролируют несколько биологических процессов. Этот метод FLAG-Biotin CLIP-seq, следовательно, глобально профилированного специального и временного расположения РНК и RBPs в клетках млекопитающих. Этот метод позволяет эффективно обнаруживать прямые РНК, связанные с белком, без SDS-PAGE и процедур переноса мембраны.
По сравнению с традиционным CLIP-seq изотопов бесплатно и не требует белка конкретных антител. Начните с покрытия около 3 миллионов эмбриональных клеток мыши STEM в 10-сантиметровой пластине и инкубации их в одночасье. На следующий день удалите среду с помощью вакуума и обработать клетки двумя миллилитров 0,25%трипсина ЭДТА в течение двух минут при комнатной температуре.
Утолить трипсин с четырьмя миллилитров свежей среды MESC, и передать клетки в 15 миллилитров центрифуги трубки. Затем центрифуга их в 300 раз G в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию и удалить супернатант. Приостановить клетки в четыре миллилитров холодного PBS и передать их обратно в 10 сантиметров пластины для перекрестного соединения.
Излучают клетки с 254 нанометровым ультрафиолетовым светом, а затем передают перекрестные клетки в 15 миллилитровую трубку. Спин вниз этой клетки в 300 раз G в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию, а затем удалить супернатант и подышеть клетки с 500 микролитров буфера А подготовлены в соответствии с рукописными указаниями. Перенесите клетки в безрновую трубку 1,5 миллилитров и инкубировать их при четырех градусах Цельсия с мягким вращением в течение 30-60 минут.
Лечить лизате с 30 микролитров DNAse 1 при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Затем остановите реакцию, добавив четыре микролитера 0,5 млара EDTA. Спин вниз нерастворимые гранулы центрифугирования на 12000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию, и передать супернатант в новый предварительно охлажденный 1,5 миллилитр трубки.
Перенесите лизат клетки на предварительно уравновешенные бусинки FLAG и инкубировать образец при четырех градусах Цельсия во время вращения в течение двух-четырех часов. После инкубации центрифуга бисера в течение двух минут при 3000 раз G и удалить супернатант. Добавить 500 микролитров буфера А в образец, и инкубируется при 4 градусах по Цельсию в течение пяти минут, затем спина вниз бисера и удалить супернатант.
Повторите стирку с Buffer A, а затем два моет с предварительно охлажденной Buffer B.To elute с тремя X FLAG-пептид, подготовить решение элюции, как описано в тексте рукописи и спина вниз FLAG-бусы. Удалите супернатант с узким кончиком пипетки конца и добавьте 200 микролитров раствора 3 X FLAG elution к каждому образцу. Инкубировать образцы в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением.
Затем спина вниз бусы в течение двух минут в 3000 раз G.Transfer супернат в свежую трубку и повторить elution дважды. Сохранить 5% элюентов для западного анализа пятно или окрашивание серебра, чтобы проверить эффективность FLAG иммунопреципиентации. Передача вытащил элюенты подготовлены стрептавидин бусы и повернуть образцы мягко при четырех градусах по Цельсию в течение одного-трех часов или на ночь.
Затем соберите шарики на магнитной подгоке и удалите супернатант. Вымойте бисер дважды с 500 микролитров Buffer C с нежным вращением в течение пяти минут за стирку. Далее, мыть бисер дважды с 500 микролитров buffer D, и дважды с 500 микролитров ледяной буфер PNK, собирая бисер на магнитной подгонке и удаления супернатанта между моет.
Для частичного пищеварения РНК добавьте 100 микролитров раствора MNA к каждому образцу и вихрю при 37 градусах Цельсия с термальным миксером в течение 10 минут. Соберите бисер с магнитным стендом в течение 30 секунд и удалите супернатант. Затем вымойте их буфером PNK-EDTA, буфером Buffer C и PNK в соответствии с рукописными указаниями.
Соберите бисер с магнитной подгоной и удалите буфер. Затем добавьте смесь реакции CIP и вихрь шарики при 37 градусов по Цельсию с термальным миксером в течение 10 минут. Быстро мыть бисер дважды с 500 микролитров ледяной PNK EDTA буфера, а затем две моет с 500 микролитров ледяной буфер PNK.
После моет, добавить 40 микролитров из трех основных связующим лигой смесь с бисером, и вихрь их при 16 градусов по Цельсию с тепловой смеситель в течение трех часов или на ночь. Эффективная перевязка связующих с союзниками имеет решающее значение для этого эксперимента. Проверьте реакцию трубки время от времени, чтобы убедиться, что они не осаждаются во время перевязки.
После инкубации повторите промывки буферами PNK EDTA и PNK, добавьте 40 микролитров PNK, смешанных с бисером, и вихрем их при 37 градусах по Цельсию с термальным миксером в течение 10 минут. Вымойте бисер буферами PNK EDTA и PNK, а затем приступайте к изоляции РНК, как описано в текстовой рукописи. По сравнению с FLAG-опосредованные или стрептавидин опосредовано один шаг сродства очистки, FLAG-Biotin тандем очистки удалены почти все основные очищенные белки, избегая загрязнения косвенных взаимодействий РНК белка.
LIN28 и WDR43, Fbio CLIP-seq были выполнены с использованием эмбриональных стволовых клеток мыши. В общей сложности для LIN28 и WDR43 было получено около 7,7 млн и 2,2 млн уникальных считых. Сравнение представлений трека показывает различные связывающие шаблоны в локусе RN45 pre-rRNA.
Кросс-связанных сайтов на GGA G мотив до-let7-g РНК LIN28, Fbio CLIP-seq или определены. Кроме того, были определены обогащенные РНК-мотивы в связывающих участках, а также процент мутировавших нуклеотидов в различных типах мутаций. Показывая, что LIN28 предпочитает связываться с нуклеотидом гена.
Ну, в 10:00 вечера, этот протокол, важно, чтобы подтвердить эффективность иммунопреципиентации, чтобы убедиться, что белок только комплексы были очищены успешно.
