Этот протокол описывает сбор массивных данных из белка-ДНК связывания microarray для primase, фермент, который временно связывается с конкретными последовательностями ДНК и, в свою очередь, катализы формирования РНК грунтовки. Это видео будет охватывать, как технология microarray может помочь пересмотреть primase сайтов распознавания последовательности и как высокая пропускная способность подход может комплимент классической биохимии. Этот метод сочетает в себе два подхода: primase ДНК связывания microarray и primase деятельности анализа.
Микроаррей предоставляет массивные данные primase связывания с последовательностями ДНК, где в качестве биохимического анализа предоставляется информация о формировании РНК грунтовки ДНК primase. Проверенная энзиматическая активность зависит от проницательности эксперимента микроаррея и его нижней пропускной способности в природе. Проверяется связь между эффективностью связывания, выбором последовательности ДНК и активностью фермента.
Определение определения последовательности с помощью микроаррея позволяет сделать точные выводы на основе массивных данных микроармей. Этот подход был использован до сих пор для описания ДНК связывающих последовательностей транскрипционных факторов. Транскрипционные факторы являются статические белки, которые плотно связываются с ДНК.
Демонстрацией процедуры будет Стефан Илич. Чтобы начать эту процедуру, предварительно мокрый микроаррей слайд, поместив его в банку коплин, содержащий 0,01%Triton-X 100. И вращаясь на лабораторном ротаторе, добавьте 125 об/мин в течение пяти минут.
Пипетка блокирующий раствор в пластиковую коробку. Затем удалите слайд microarray из банки coplin. Используйте тонкую салфетку, чтобы управлять стороной не-ДНК и краями слайда.
Медленно поместите микроаррей в пластиковую коробку. Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа с медленной тряской. После этого, мыть слайд один раз с 0,01%Tween-20 в PBS.
На лабораторном ротаторе при 125 об/мин в течение пяти минут. Удалите Tween-20 и промойте слайд один раз с 0,01%Triton-X 100 в PBS на лабораторный ротатор при 125 об/мин в течение двух минут. Затем быстро перенесите слайд в банку с коплином, содержащую PBS.
Во-первых, собрать камеру PMB, как указано в текстовом протоколе. Поместите слайд в назначенное пространство. Используйте пинцет, чтобы подтолкнуть его вниз и слева.
Поместите силиконовую прокладку сверху, убедившись, что она хорошо выровнена с нижней частью камеры PBM. Затем закройте камеру и затяните винты по диагонали. Pipette смесь связывания протеина в каждую наилучшим образом прокладки.
Затем инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Для начала, пипетка 0.05%Tween-20 в PBS в камеру PBM, чтобы кратко мыть слайд. Используя вакуумный аспиратор, удалите раствор из колодцев камеры, чтобы не касаться пятен ДНК.
Повторите это, кратко мыть слайд с PBS. И использовать вакуум, чтобы удалить раствор из колодцев камеры, будучи осторожным, чтобы не прикасаться к пятнам ДНК. Далее добавьте Alexa 488 спряженные анти-его антитела к каждому колодец камеры PBM.
Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого, кратко мыть слайд внутри камеры PBM, добавив несколько капель 0,05%Tween-20 в PBS в каждой хорошо. И используйте вакуумный аспиратор, чтобы удалить раствор из колодцев камеры, будьте осторожны, чтобы не коснуться пятна ДНК.
Разонимите камеру PBM и удалите слайд. Промыть слайды дважды в 0,05%Tween-20 в PBS, с каждым полоскания продолжительностью три минуты. Затем, промыть слайды два раза в PBS, с каждым полоскания продолжительностью три минуты каждый.
И один раз в двойной дистиллированной воде в течение трех минут. Высушите горки сжатым воздухом. И хранить их в темной коробке слайда до готовности к сканированию.
Когда вы будете готовы, используйте микроаррей сканер для сканирования чипа с возбуждением 495 нанометров и выброс 19 нанометров. И собирать медианную интенсивность флуоресценции. В этом исследовании pi throughput primase профилирование используется для карты primase связывающих сайтов, в том числе те, которые трудно, если не невозможно наблюдать с помощью классических инструментов.
Важно отметить, что первичное профилирование pi throughput позволяет пересмотреть традиционное понимание первичных обязательных сайтов. Особенно пи пропускной способности первичного профилирования показывает связывающие особенности в дополнение к известным 5'GTC3'признание последовательностей, что приводит к изменениям в функциональной деятельности T7 ДНК primase. А именно, определены две группы последовательностей.
Сильные связывающие последовательности ДНК, которые содержали TG на флангах и слабые связывающие последовательности ДНК, которые содержали AG на флангах. Не было обнаружено никакой первичной привязки к шаблонам ДНК, которые отсутствовали 5'GTC3'within их последовательности. Первичные сайты распознавания ДНК, которые содержат специфические особенности, такие как богатые фланги TG, увеличивают привязку ДНК primase до 10 раз.
Удивительно, но они также увеличивают длину вновь образованной РНК. Важно отметить, что высокопутное первичное профилирование позволяет нам наблюдать и количественно оценить изменчивость длины грунтовки по отношению к последовательности шаблона ДНК. При выполнении этой процедуры шаги стирки должны быть тонкими.
И буферы должны содержать компоненты, которые вошли в примат ДНК. Также биохимически определяется порог бесполезных связывающих событий. Поэтому анализ микроаррея недостаточен.
Такие методы, как поверхностный плазменный резонанс и анализ сдвига геля, могут определить связывающее сродство primase для выбора последовательностей ДНК. Моя лаборатория реализует модели прогнозирования машинного обучения для обнаружения детерминантов primase sequence, которые дают продуктивные грунтовки, которые могут быть расширены полимеразой ДНК. В эпоху больших данных, внедрения статистических методов для анализа больших данных, метод, безусловно, поможет лучше охарактеризовать конкретные последовательности ДНК и связать распознавание последовательности с деятельностью primase.
Любой человек, работающий с радиацией, должен иметь глубокое понимание правил и опасностей, связанных с использованием ионизирующего излучения. Должны пройти обучение и должны работать с оборудованием безопасности.
