Наше исследование сосредоточено на механизме эпигенетического наследования. В частности, процесс рециркуляции родительских гистонов связан с репликацией ДНК, который представляет собой первый эмиссирующий этап эпигенетического наследования. Было установлено, что множественное отложение родительских гистонов, которые участвуют в репликации ДНК, играют важную роль в родительской рециркуляции гистонов.
К ним относятся комплекс D helicase, ДНК-полимераза и комплекс репликации для защиты. В этой области исследований используются традиционные генетические и биохимические подходы. Традиционно, для понимания процесса переноса родительских гистонов используются методы высокопроизводительного секвенирования.
До того, как было разработано обогащение и секвенирование белок-ассоциированной ДНК, или экспериментальный метод, было сложно изучить процесс переноса родительских гистонов. Метод эксперимента стал мощным инструментом для решения этих фундаментальных вопросов. Для начала подпилите гранулы дрожжевых клеток и снова подвесьте их путем мягкого вортексинга.
Затем промойте его 0,4 миллилитрами буфера для лизиса CHIP, содержащего ингибиторы протеазы и смесь антибиотиков для предотвращения бактериального загрязнения. Центрифугируйте смесь при 5 000 г в течение одной минуты. Далее добавьте в гранулу 0,1 миллилитра буфера для лизиса CHIP с ингибиторами протеазы и смесью антибиотиков.
Далее следует примерно 100 микролитров 0,5-миллиметровых стеклянных шариков. Лизируйте клетки с помощью бусин в течение трех циклов в холодной комнате с температурой четыре градуса Цельсия. С помощью горячей иглы 16 калибра проделайте отверстия в нижней части трубки.
Соберите лизат, поместив проколотую пробирку в пустую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 миллилитров, и центрифугируйте при 1600 G в течение двух минут при комнатной температуре. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Фракция клеточного мусора будет содержать хроматин.
Повторно суспендируйте клеточные гранулы путем пипетирования в 0,35 мл добавленной микрококковой нуклеазы, или буфера для расщепления МНазы. Далее добавьте в суспензию 10 единиц MNase. Аккуратно перемешайте, перевернув четыре-шесть раз, и выдерживайте на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.
Утолите переваривание MNase, добавив пять микролитров 0,5 молярного ЭДТА до конечной концентрации 10 миллимоляров. Аккуратно перемешайте с помощью инверсии и поместите тюбик на лед не менее чем на 30 минут. Используя микропробирки Bioruptor объемом 1,5 миллилитра, обрабатывайте реакционную смесь ультразвуком на высокой мощности в течение трех минут с 30 секундами включения и 30 секунд выключения.
Затем центрифугируйте при 10 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки и снова центрифугируйте при 10 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем соберите примерно 400 микролитров надосадочной жидкости.
Сохраните 30 микролитров в качестве входной ДНК для извлечения ДНК и заморозьте при температуре минус 20 градусов Цельсия. Используйте оставшиеся 370 микролитров клеточного лизата для иммунопреципитации хроматина гистонов. Для начала вскипятите около 150 микролитров ранее полученных входных образцов и образцов H3K4me3 CHIP на термоблоке при температуре 100 градусов Цельсия В течение пяти минут сразу охладите образец на льду в течение пяти минут.
Затем добавьте в образец необходимое количество упомянутых компонентов. Мутируйте образец в течение двух часов на роторе при температуре четыре градуса Цельсия и 10 оборотах в минуту. Переложите смесь в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 20 микролитров промытого белка G Сефарозные шарики.
Мутируйте смесь в течение часа при температуре четыре градуса Цельсия на роторе при 10 оборотах в минуту. Вращайте трубки при комнатной температуре при 800 G в течение одной минуты. Промойте бусины три раза одним миллилитром холодного Бромо-дезоксиуридина, или буфера иммунопреципитации BrdU, вращая по три минуты при каждой стирке.
Снова центрифугируйте пробирку и промойте одним миллилитром TE-буфера в течение трех минут. Снова вращайте трубки при температуре 800 G в течение одной минуты при комнатной температуре и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Добавьте в гранулы 100 микролитров TE-буфера с 1% SDS.
Выдерживайте смесь при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут, затем вращайте при 800 G в течение одной минуты при комнатной температуре. Очистите надосадочную жидкость до 18 микролитров элюирующего буфера с помощью колонок для очистки ДНК для получения образцов иммунопреципитации BrdU и H3K4me3 eSPAN. Подготовьте одноцепочечную библиотеку ДНК с указанными образцами, следуя инструкции по подготовке набора для одноцепочечной ДНК и библиотеки ДНК с низким входом.
Очистите продукт лигирования до 20 микролитров буфера с низким содержанием ЭДТА. Амплифицируйте библиотеку ДНК с помощью 50 микролитров реакционной смеси из набора для подготовки одноцепочечной библиотеки ДНК. Следуя отображаемому циклу, амплифицируйте ПЦР-смесь.
Очистите продукты ПЦР, смешав их с 60 микролитрами шариков, предварительно подогретых до 30 градусов Цельсия. Тщательно перемешайте продукты ПЦР и шарики. Дайте смеси настояться при комнатной температуре в течение пяти минут.
Свяжите бусины на магнитной подставке на три минуты и дважды промойте их 200 микролитрами свежеприготовленного 80%-ного этанола. Высушите шарики на воздухе в течение двух минут и разбавьте ДНК до 20 микролитров буфера с низким содержанием ЭДТА, входящего в комплект для подготовки библиотеки ДНК. Измерение концентрации библиотеки и распределения фрагментов по размерам с помощью систем электрофореза высокого разрешения.
Объедините равное количество отдельных библиотек, включая входные образцы хроматина H3K4me3, иммунопреципитацию BrdU, eSPAN для выполнения параллельного парного секвенирования. Типичный анализ геля библиотеки секвенирования ДНК H3K4me3 eSPAN выявил лестничную структуру нуклеосом хроматина. Основная полоса мононуклеосом появлялась на 270 парах оснований, где адаптеры добавлялись к фрагменту ДНК, полученному в результате расщепления.
Картирование различных образцов выявило пики на отдельных нуклеосомах, окружающих исходную последовательность 607, автономно реплицирующуюся последовательность 607 в клетках дикого типа и mcm2-3A. Среднее смещение цепи показало, что в дрожжевых клетках дикого типа родительское отложение гистонов демонстрировало небольшое смещение в сторону отстающей цепи. Однако у мутантного родителя гистон H3H4 был перенесен в ведущую цепь.
