Основываясь на микрофлюидной технологии, изоляция и характеристика КТК от нормальных кровяных клеток не требуют использования конкретных биомаркеров КТК и совместимы с клеточной культурой. Этот протокол облегчает высокий уровень извлечения КТК и обеспечивает обширный цитологический анализ КТК путем оценки злокачественных цитоморфологических характеристик. Выражение PD-L1 по КТК имеет прогностический значение в лечении рака легких.
Улучшение его обнаружения с помощью этого теста может способствовать улучшению управления пациентами в долгосрочной перспективе. Другие применения этого протокола включают обнаружение генетических аберраций с использованием FISH, или проведение транскриптомного анализа на КТК, а также изоляцию клеток фетального происхождения у матерей. Демонстрацией процедуры будет Джули Баландье, техник из нашей лаборатории.
Для до аналитического обогащения опухолевых клеток сначала соберите 7,5 миллилитров крови в трубку EDTA калия и держите образец под нежным возбуждением, чтобы избежать осаждения клеток и свертывания крови. В течение шести часов после сбора используйте серологическую пипетку под микробиологическим шкафом безопасности, чтобы перевести до 7,5 миллилитров цельной крови в новую 50-миллилитровую центрифугу и центрифугировать образец на 10 минут при 1600 Г при комнатной температуре. В конце центрифугации используйте перенесите пипетки для сбора плазменной фракции, не нарушая баффи пальто, и разбавляют плазму эквивалентным объемом PBS, до 7,5 миллилитров.
Затем осторожно добавьте буфер лиза красных кровяных телец в образец крови, до конечного объема в 30 миллилитров, и аккуратно инвертировать трубку сбора крови три раза, прежде чем поместить трубку при комнатной температуре в течение 10 минут. В конце инкубации, собирать клетки центрифугации, и тщательно удалить все, кроме последних четырех до пяти миллилитров супернатанта. Используйте фильтрованный микропипет, чтобы удалить оставшийся супернатант, и использовать P1000 микропипет с фильтрованным кончиком, чтобы добавить один миллилитр буфера повторного незаменимости вниз по стене трубки.
Чтобы избежать введения пузырьков, повторно использовать клеточные гранулы с нежным пипетки, пока образец является однородным. Когда гранулы были повторно использованы, добавить дополнительные три миллилитров буфера повторного незаменимия к стене трубки, не вводя пузырьки, и осторожно смешать клетки снова. Для спирального микрофлюидного устройства, циркулирующего обогащение опухолевых клеток, сначала загрузите новый спиральный микрофлюидный чип на устройство и загрузите одну пустую 50-миллилитровую центрифугу в каждый из входных и выходных портов.
Нажмите кнопку "Премьер" спиральное микрофлюидное устройство в течение трех минут. Удаление входных и выходных труб в конце цикла. Загрузите повторно взятый образец крови в входной порт и загрузите в выходной порт четкую 15-миллилитровую коническую трубку.
Затем нажмите запустить, и выберите программу три, чтобы инициировать 31 минуту циркулирующих программы обогащения опухолевых клеток. В конце цикла перенесите выходную трубку в центрифугу и используйте пятими миллилитровую серологическую пипетку, чтобы удалить все, кроме последних двух миллилитров супернатанта. Затем используйте микропайп, чтобы удалить все, кроме последних 100 микролитров супернатанта.
Для окрашивания иммунофлюоресценции подсчитайте клетки в гемоцитометре и разбавьте обогащенный образец в один раз от десяти до пятой клетки на 100 микролитров 0,2%анти-связывающей концентрации раствора. Далее используйте ватный тампон, пропитанный 50 микролитров анти-связывающего раствора, чтобы увлажнить контур камеры образца, и поместите полилин стеклянную горку в образец камеры. Закройте камеру, и пипетка вверх и вниз три раза, чтобы покрыть кончик микропипета с связывающим раствором перед повторной выборки образца в последние 100 микролитров супернатанта.
Передача клеточного раствора в выборку камеры и цитоскопии образца в выделенной центрифуге при 400 вращениях в минуту в течение четырех минут, при низком ускорении. В конце центрифуги поместите силиконовый изолятор вокруг области осаждения и дайте слайду высохнуть под микробиологическим шкафом безопасности в течение двух минут, затем зафиксируете образец цитоспуна 100 микролитров 4%paraformaldehyde в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем три две минуты моет с 200 микролитров PBS на стирку, при комнатной температуре. После последней стирки блокируйте любую неспецифическую привязку 30-минутной инкубацией при блокировании реагента при комнатной температуре, а затем маркировать 100 микролитров раствора антитела, представляющих интерес.
Поместите помеченную горку в чашку Петри на 100 на 15 миллилитров на кусок абсорбющей бумаги, увлажненной двумя миллилитровми стерильной воды, и поместите блюдо закрытым, при четырех градусах Цельсия на ночь, защищенным от света. На следующее утро, мыть образец три раза с PBS, как попродемонстрировано, и смонтировать образец с 10 микролитров соответствующего монтажного раствора и стеклянной крышкой скольжения. Затем запечатать крышку скольжения с четким лаком для ногтей.
Для изображения образцов цитоспуна загрузите слайд на прямой флуоресцентный микроскоп с помощью моторизованной платформы X Y и выберите цель 20x и соответствующие каналы в соответствии с флуорофорами, используемыми для маркировки антител. Включите ртутную лампу и адаптируйте микроскоп и связанное с ним программное обеспечение к полуавтомизированной съемке. Когда лампа будет готова, в меню приобретения определите четыре канала, установите время экспозиции и определите плитки для сканирования.
Нажмите плитки, и продвинутый эксперимент, и определить область для сканирования. Затем отрегулируйте фокус на экране и нажмите кнопку начать эксперимент. В конце эксперимента экспортируйте файлы TIF для каждого канала и, в частности, назовите файл, чтобы включить образец, количество раз, краситель и количество субт плитки.
Для анализа изображений откройте программное обеспечение для анализа изображений с веб-сайта Института Широкого и нажмите файл, конвейер из файла и анализ четырех каналов CTC. Замойдайте файлы в список файлов и обновйте метаданные, чтобы сгруппить файлы по плиткам. Затем нажмите проанализировать изображения, чтобы открыть файл электронной таблицы, соответствующий параметрам интенсивности измерения.
Без оптимизированного протокола обеззараживания, высокое бактериальное загрязнение наблюдается в тканях культур обогащенных линий клеток A549 только через 24 часа, вызывая смерть и цитоморфологические изменения в эукариотических клетках. В отличие от этого, после протокола очистки, живые клетки A549 получаются в 2D культурах после 10 часов культуры тканей и среднего удаления, в условиях 3D культуры, и в образцах пациента. Используя жидкий иммунофлюоресцентный анализ окрашивания или иммунофлюоресцентное окрашивание на полилиновых слайдах с цитоскопией, можно наблюдать четкое различие в количестве ядер, перечисленных между двумя анализами.
Без шага цитоскопина, трудно дифференцировать белые кровяные тельца от опухолевых клеток, из-за размытых контуров в нецитоспиновых клеток preps. Здесь различные репрезентативные выводы из различных образцов пациента можно наблюдать, с остаточным подсчетом белых кровяных телец, в частности, определяется как сильно переменной, и зависит от всего образца крови. Высокая изменчивость наблюдалась также в циркулирующих опухолевых клетках суб популяций, полученных.
Каждая клетка на цитоскопине идентифицируется программным обеспечением анализа изображений и позволяет отслеживать ячейку и вручную подтверждать результаты по мере необходимости. Действительно, экспериментальный анализ продемонстрировал согласие между ручным перечислением и перечислением программного обеспечения для анализа изображений. Установка в доме разработан влажной чашки Петри для гибридизации белка-антитела имеет решающее значение, так как устройство остается достаточно влажным на протяжении всего инкубации времени.
