Этот метод имеет важное значение, поскольку ни один другой протокол не позволяет анализировать недавно синтезированную РНК в такой короткой шкале времени и позволяет проводить эксперименты с пульсом с таким коротким пульсом. Этот протокол хорошо работает с истощением белка, например, с протоколом Best AID 4U. Основным преимуществом является то, что фон низкий.
Это позволяет короткое время маркировки, удалив почти все нетизолированную РНК. В письменном протоколе также подробно много различных типов экспериментов, которые могут быть выполнены и как интегрировать их в этот метод. Чтобы начать эту процедуру, выращивать дрожжи в среде YMM до OD 600 между 0,6 и 0,8.
В дымовой капот добавьте метанол, эквивалентный 30-50% от предполагаемого объема образца, в 50 миллилитровую трубку. Закройте трубки плотно, этикетки их, и поместите их на сухой лед, чтобы охладить. Далее наклеить две миллилитровые трубки для длительного хранения образцов и поместить на лед для охлаждения.
Добавьте бисер цирконии в две миллилитровые трубки. Охладить по крайней мере один миллилитр воды на образец на льду. Если к культуре добавляется шип S.pombe, поместите алициты изолированных клеток S.pombe на лед, чтобы оттаять.
Vortex оттаял aliquot и добавить его в культуру. Затем добавьте 4tU в культуру к концентрации 10 микромоляров и тщательно перемешайте. Thio-лейбл в течение времени от 15 секунд до пяти минут.
Возьмите образцы культуры через регулярные промежутки времени до конца курса времени. Добавьте каждый образец в одну из подготовленных центрифугных трубок, содержащих метанол. Запечатать каждую трубку, встряхнуть, тщательно перемешать, и поместить на сухой лед.
После того, как все образцы были сделаны, поместите их все на лед. Убедитесь, что ни один из образцов не замерз. Если таковые имеются заморожены, тепло их мягко в руке, инвертирование постоянно.
Центрифуга клетки на 3000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение двух минут, чтобы гранулировать клетки. Слейте жидкость, и повторно гранулы, по крайней мере один миллилитр ледяной воды энергично трубопроводов вверх и вниз. Перенесите подвеску на подготовленную крышку винта и поместите трубку на лед.
Центрифуга образцов кратко на скорости более 13000 раз г, чтобы повторно гранулировать клетки. Затем поместите их обратно на лед, и удалить жидкость. Во-первых, добавьте в 400 микролитров буфера АЕ, 40 микролитров SDS и 800 микролитров фенола при низком рН.
Resuspend вихрем в течение 10 секунд. Затем высасывай клетки в гомогенизаторе в течение трех двух минут очередей при наименьшей мощности настройки. Оставьте образцы на льду на две минуты между импульсами гомогенизации.
Поместите обливные клетки на сухой лед в течение пяти минут, пока он не затвердеет. Затем используйте микроцентрифуг, чтобы вращать клетки со скоростью более 13 000 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. После этого выполните извлечения фенола хлороформа и извлечения хлороформа, как указано в текстовом протоколе.
Добавить от 1/3 до 1/2 объема 10 молярного хлорида лития и перемешать, чтобы вызвать РНК. Центрифуга на скорости более 13 000 раз г в течение пяти минут. Удалите жидкость, и кратко повторно спина образца, чтобы удалить отбросы.
Затем промыть гранулы с 300 до 500 микролитров 70% этанола. Центрифуга промыть гранулы кратко, и удалить все оставшиеся этанола. Повторно растворить гранулы РНК в 90 микролитров TE при рН 7.0 путем нагрева при 65 градусах по Цельсию во время встряхивания.
После проверки на полную РНК solubilization, передать подвеску на 0,2 миллилитров трубки. Для начала, биотинилат, добавив 10 микролитров раствора HPDP-биотина в РНК и тщательно перемешать. Инкубировать в темноте при 65 градусах по Цельсию в течение 15 до 30 минут.
Далее подготовь небольшой объем смолы, столбец исключения размера, чтобы исключить неинкорпорированный биотин. Снимите нижнюю метку колонны, ослабьте крышку и поместите колонну в двухми миллилитровую центрифугу. Центрифуга в 1500 раз г в течение одной минуты, чтобы смыть буфер и отбросить поток через.
Затем аккуратно добавьте 0,3 миллилитров TE в верхнюю часть колонны и снова вращайте, используя те же условия. Перенесите промытую колонку в свежую 1,5 миллилитровую трубку. Когда инкубация образца будет завершена, добавьте образец в верхнюю часть столбца.
Центрифуга в 1500 раз г в течение двух минут, оставляя биотинилированный образец РНК на дне трубки. Отбросьте столбец. И добавить от 1/3 до 1/2 тома 10 молярного хлорида лития в трубку, содержащую образец.
Смешайте, чтобы повторно ускорить РНК. Во-первых, повторно растворить РНК в 200 микролитров DEPC-обработанной воды. Измерьте концентрацию РНК и рассчитайте объемы для каждого образца, который даст одинаковое количество РНК для всех образцов.
Добавьте это количество РНК в свежую трубку и добавьте воду, обработанную DEPC, до общего объема в 200 микролитров. Когда образец находится при комнатной температуре, добавьте 25 микролитров буфера 10 x NaTM, 25 микролитров одного молярного фосфата натрия и 2,5 микролитера 10%SDS. Тщательно перемешать и центрифугу аккуратно примерно 100 раз г менее чем за 30 секунд.
Подготовь два миллилитров буфера бисера для каждого образца с буфером х NaTM, 0,1 молярного фосфата натрия и 0,1% SDS. Добавьте 50 микролитров стрептавидиновых бусин к низкой удержанию 1,5 миллилитровой трубки. Поместите трубку на магнитную стойку и ждать, пока бисер урегулировать.
Затем удалите жидкость путем аспирации. Чтобы вымыть бисер, добавьте 200 миллилитров буфера бисера и вихря до тех пор, пока гранулы шарика полностью не будут перерасходоваться. Центрифуга трубки примерно в 100 раз г в течение максимум пяти секунд.
Поместите трубку в магнитную стойку, чтобы шарики были захвачены магнитом. Удалите жидкость путем аспирации, если есть небольшое количество образцов. Слейте жидкость, а затем аспирировать, если Есть много образцов.
Блок с 200 микролитров буфера бисера, 10 микролитров гликогена и 2,5 микролитров тРНК. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут при вращающемся конце над концом на умеренной скорости. После этого снимите жидкость и снова вымойте, как указано в текстовом протоколе.
Переподход бисера в образце, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут во время вращения. Во время этой инкубации приготовьте свежую 1,5 миллилитровую трубку для каждого образца. Добавьте 1/10 тома трех ацетата молярного натрия при рН 5,3 и 20 микрограммах гликогена.
Центрифуга примерно 100 раз г в течение трех секунд. Снимите неохваченную РНК с бисера и вымойте их, как указано в текстовом протоколе. Чтобы утоить РНК, добавьте в бисер 50 микролитров свежеприготовленного 0,7 молярного бета меркаптоэтанола.
После вихря и центрифуги поместите суспензию в магнитную стойку. Pipette РНК, содержащий раствор в подготовленных 1,5 миллилитров центрифуги труб. Elute еще раз, как описано ранее.
Затем поместите образец обратно в магнитную стойку, чтобы удалить остаточные бусы из элайта РНК и передать жидкость в свежей, низкой привязки 0,5 миллилитра центрифуги трубки. Смешайте образец. А затем добавить 2,5 тома этанола для осаждения nsRNA.
После смешивания и инкубации центрифуга со скоростью не менее 13 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Типичные урожаи для snRNA восстановлены с помощью этого протокола показаны здесь. Обратите внимание, что восстановление РНК в нулевой точке времени является очень небольшой частью, что восстановлено из более длительных точек времени только 0,3 микрограмма РНК восстанавливается примерно из 30 миллиардов клеток.
После всего лишь 30 секунд маркировки, однако, более чем в два раза больше РНК собирается из того же количества клеток. В следе биоанализа наши прекурсоры РНК можно рассматривать как пик около 1000 нуклеотидов и дублет пиков в 1 700-1800 нуклеотидов. Обилие этих промежуточных увеличивается по мере того, как продолжается тиолирование.
Затем проводится тиолирование с пробами, взятыми с интервалом в 15 секунд с начала тио-маркировки, и контролируется обработка транскрипта РНК ACT1. Как видно до мРНК и лариаты генерируются даже после всего лишь 15 секунд маркировки. Примерно через 45 секунд до одной минуты, количество лариатов и предварительной мРНК достичь равновесия с таким же количеством этих видов РНК создаются транскрипции, как обрабатываются прочь путем сращивания.
Наиболее сложные шаги, связанные с бисером, стирка, и блокирование. Будьте осторожны, чтобы не потерять бисер, или дать им высохнуть. После очистки недавно синтезированной РНК можно использовать любую традиционную процедуру анализа РНК.
Рекомендуется запустить РНК на биоанализе или аналогичный. После этого мы обычно используем ККПЧ и РНК-Сек для анализа РНК. Этот метод оказался идеальным для анализа кинетики обработки РНК.
Наиболее опасными шагами являются те, которые используют фенол и хлороформ в экстракции РНК. Каждый раз, когда вы используете эти химические вещества в незапечатанные контейнера, сделать это в дым капот, и носить соответствующую защитную одежду, лабораторное пальто, и перчатки. Позаботьтесь о том, чтобы в нитью винтовой трубки не было бисера цирконии, так как это приведет к утечке.
