Этот метод решает общую проблему в полевых условиях и обеспечивает полный рабочий процесс для быстрой изоляции и характеристики отдельных внеклеточных пузырьков с конкретными маркерами интереса. Анализ слежения за наночастицами является полуавтоматическим методом. Он использует свойства рассеяния света и броуианского движения для анализа распределения размеров внеклеточных пузырьков.
Демонстрацией процедуры будет Вера Шмидт, аспирантка нашей лаборатории. Чтобы изолировать внеклеточные пузырьки, после сбора двух миллилитров образцов всей крови человека в сыворотке,-отделяющих трубки, позволяют образцам свертывать в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем отделить клетки от сыворотки центрифугации. Перенесите один миллилитр сыворотки из каждого образца в отдельные 1,5 миллилитровые реакционные трубки для центрифугации для удаления тромбоцитов и перенесите 100 микролитров плазмы с тромбоцитов в новые 1,5 миллилитровые реакционные трубки.
Далее добавьте 25 микролитров раствора экзосомных осадков в плазму и тщательно вихревые образцы. После 30-минутной инкубации на льду соберите внеклеточные пузырьки путем центрифугации. Гранулы будут отображаться как бежевый или белый цвет.
Аспирировать супернатант и центрифугировать образец снова. Затем удалите все трансы жидкости и повторно помесить гранулы в 100 микролитров PBS. Чтобы испачкать клеточные мембраны пузырьков, добавьте 10 микролитров подвески EV в 50 микролитров свежеприготовленного раствора этанолового красителя PKH67 и тщательно перемешайте.
Через пять минут при комнатной температуре в темноте разбавьте 50 микролитров окрашенной внеклеточной суспензии с 2,5 миллилитров дистиллированной воды в 15-миллилитровой конической трубке с тщательным смешиванием. Чтобы обозначить пузырьки антителами, разбавьте от 10 до 20 микролитров неотренимной внеклеточной суспензии с 50 микролитров дистиллированной воды в 1,5 миллилитровой реакционной трубке с тщательным смешиванием. Добавьте от 2,5 до 5 микролитров антител, представляющих интерес для реакционной трубки, с тщательным смешиванием, для 30-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте.
Затем перенесите 50 микролитров помеченных пузырьков в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую соответствующий экспериментальный объем дистиллированной воды, с тщательным смешиванием, как указано в таблице. Прежде чем анализировать окрашенные или помеченные внеклеточные пузырьки, сначала перемести фильтр флуоресценции в оптический путь микроскопа и камеры, и запустите программу, следуя инструкциям на экране для автоматизированной реализации. Под вкладкой Проверка клеток, выберите правильный номер клетки для измерения флуоресценции и эталонного положения для оптики, чтобы подтвердить, что лазер и микроскоп находятся в общем фокусе.
Используйте шприц, чтобы промыть клеточный канал с 10 миллилитров дистиллированной воды, заботясь о том, что измерительные клетки свободны от пузырьков воздуха и что пузырьки воздуха не вводятся в систему. Далее разбавляют 10 микролитров 200-нанометрового размера флуоресценцией, помеченными полистиролом частицами в 990 микролитров дистиллированной воды, и добавляют 10 микролитров этой частицы суспензии в 15 миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров дистиллированной воды. Затем ввините 2,5 миллилитров раствора первой разбавленной частицы в клеточный канал и нажмите Optimize Focus, чтобы настроить камеру.
Чтобы измерить образец, промыть клеточный канал несколько раз с 10 миллилитров дистиллированной воды и ввести окрашенные внеклеточной подвески пузырьков. Используя эталонную позицию, отрегулируйте соответствующие параметры приобретения под вкладкой Cell Check, как указано в таблице. Чтобы определить оптимальный диапазон чувствительности, нажмите Number of Particles vs.
Чувствительность, для отображения кривой измеренных частиц на экран для различных уровней чувствительности. Для параметра Затвора отрегулируйте период времени, в течение которого камера позволяет свету проходить в течение определенного интервала. Для параметров Postacquisition выберите минимальную яркость 20, минимальный размер 20 нанометров и максимальный размер измерения 500 нанометров.
Обратите внимание на количество обнаруженных частиц в поле зрения дисплея. Бар рассеяния должен быть от зеленого до оранжевого, от 50 до 300 частиц диапазона. Нажмите Проверьте дрейф частиц в нулевом вольте и откройте вкладку Измерения.
Нажмите Run Video Acquisition и установите количество экспериментов до трех-пяти, а задержку времени между экспериментами до нуля минут. Установите количество отдельных субтомных позиций до 11 и количество циклов измерений до 10 в каждом измерительных позициях, в которых должны быть проанализированы частицы. Затем выберите папку, создайте новое имя файла и нажмите Кнопку Хорошо, чтобы начать измерение.
В конце анализа откройте вкладку «Анализ» для проверки результатов. Затем проверьте среднее количество частиц на позицию, общее количество отслеживаемых частиц и концентрацию частиц, ширину распределения частиц, значение среднего и стандартное отклонение. Использование флуоресцентных бусин для регулировки и калибровки измерения дает оптимальную чувствительность настройки 85% Использование этих параметров, камера отображает резкое изображение и повторные измерения демонстрируют низкое стандартное отклонение.
Окрашивание с набором сотового связующих, который включает в себя флуоресцентный клеточный связующий, который включает в себя зеленый флуоресцентный краситель с длинными, алифатными хвостами в липидные области клеточной мембраны, показывает сильную корреляцию между чувствительностью и количеством измеренных частиц. Внеклеточное окрашивание пузырьков антителом к интересному белку указывает на распределение частиц от 220 до 1 145 нанометров, с максимальным максимальным размером 541 нанометров. Никакие внеклеточные пузырьки не обнаруживаются после окрашивания антителами воды, свободной от пузырьков, до чувствительности, близкой к 100%, если измерение начато, когда дрейф превышает 5 микрометров в секунду, отдельные повторения демонстрируют явные отклонения.
Важно отметить, что использование фторсхейна изотиоцианата в качестве фторхрома приводит к неточным и невоспроизводимым измерениям, так как этот фторфор склонен к быстрому фототравмингу. Этот протокол отвечает ведущему спросу многих исследователей в этой области на быструю характеристику одиночных внеклеточных пузырьков с использованием определенных маркеров. Несмотря на то, что за последнее десятилетие методы значительно улучшились, до сих пор нет стандартизированного протокола для анализа отдельных внеклеточных пузырьков.
Независимо от будущего прогресса исследований по внеклеточной биологии пузырьков, этот метод обеспечивает быстрый и надежный протокол для характеристики одиночных внеклеточных пузырьков с использованием конкретных маркеров. Поскольку наши текущие протоколы не предполагают длительного времени обработки или трудоемких шагов, они также подходят для высокой пропускной способности выборки.
