Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет выяснить роль клеточных сил во многих физиологических и патологических процессов, таких как заживление ран и метастазы рака, например. Основным преимуществом этой техники, основанной на механике, является ее способность одновременно нарушать клеточные соединения и измерять ее воздействие на механические силы, генерируемые клетками, в основном тяги и межклеточные стрессоры. Наш протокол применим к широкому спектру патофизиологических процессов, таких как метастазы рака, атеросклероз и гипертония, например.
Наши методы могут быть интегрированы для выполнения как биохимического, так и биомеханического анализа с моделями орган-на-чипе, биоинженерных тканевых конструкций, систем доставки лекарств in vitro и систем совместной культуры тканей. Наш протокол довольно прост в работе. Тем не менее, мы советуем тем, кто делает этот протокол в первый раз, чтобы иметь терпение и не спешить через шаги этого протокола.
Наш протокол имеет уникальные шаги, которые могут быть не ясны для пользователей, впервые. Поэтому мы призываем пользователей следовать нашим письменным пошаговим процедурам и использовать визуальные демонстрации в качестве руководства. Для начала приготовьте слепо-силановый раствор, смешивая 200 миллилитров ультра чистой воды с 80 микролитров уксусной кислоты и 50 микролитров силанового метакрилата.
Перемешать раствор Bind-silane на тарелке перемешать, по крайней мере один час. Относитесь к центру хорошо чашки Петри с раствором Bind-silane в течение 45 минут. Удалите раствор Bind-silane и промойте чашку Петри ультра чистой водой два-три раза.
Высушите поверхность чашки Петри и храните при комнатной температуре для дальнейшего использования. Для приготовления гидрогельного раствора смешайте 12,49 миллилитров ультра чистой воды до 2,062 миллилитров 40%акриламида и 375 микролитров 2%бисакриламида в 15-миллилитровой центрифуге трубки. Добавьте в раствор гидрогеля 80 микролитров флуоресцентных бусин.
Аккуратно встряхните трубку, чтобы смешать бисер с раствором геля. Держите крышку свободно на центрифуге трубки и поместите его в вакуумную камеру. Де-газ гель раствор, по крайней мере 45 минут в вакуумной камере.
Для полимеризации гидрогеля сначала добавьте 75 микролитров 10%аммония персульфата, а затем добавьте восемь микролитров TEMED в раствор гидрогеля. Поместите 24 микролитров гидрогеля в центр чашки Петри. Нажмите на гидрогель с 18-миллиметровым крышкой скольжения, чтобы сгладить гидрогель и сделать высоту около 100 микрометров.
Подождите, по крайней мере от 30 до 40 минут для полимеризации геля. Погрузите полимеризованный гидрогель в ультра чистую воду, чтобы предотвратить обезвоживание геля. Обложка Петри блюдо с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоотбел флуоресцентные бусы и хранить при четырех градусах по Цельсию.
Во-первых, смешать pdMS силиконовой базы с силиконовым лечебным агентом в соотношении 20 к одному в 50-миллилитровой центрифуги трубки. Переверните трубку вверх дном и встряхните энергично несколько раз, чтобы обеспечить правильное смешивание решения PDMS. Удалите пузырьки в растворе PDMS путем центрифугирования в течение одной минуты при 190 раз G.Pour пять-шесть миллилитров раствора PDMS в центре 100-миллиметровой чашки Петри и агитировать блюдо, пока pdMS решение охватывает всю поверхность чашки Петри.
Лечить pdMS решение на ночь при 50 до 60 градусов по Цельсию. Затем удалите круговой трафарет PDMS диаметром 16 миллиметров с помощью перфоратора отверстия. Используйте биопсию диаметром 1,25 миллиметра для создания небольших отверстий в трафарете PDMS.
Стерилизовать ТРАфареты PDMS путем погружения их в 70% этанола в течение двух-трех минут, аспирации от избыточного этанола, а затем размещение под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут. Аспирировать излишки жидкости и удалить крышку скольжения из гидрогеля. Поместите трафарет PDMS на поверхность гидрогеля и используйте пинцет, чтобы применить световое давление к трафарету PDMS, чтобы обеспечить водонепроницаемое уплотнение между трафаретом PDMS и поверхностью гидрогеля.
Обложка поверхности гидрогеля с Сульфо-SAMPA растворяется в 0,1 молярного hePES буферного раствора в концентрации от одного до 1000 и место гидрогеля под УЛЬТРА лампы с мощностью 36 Вт в течение восьми минут. Аспирировать избыток раствора Sulfo-SAMPA и HEPES и промыть гидрогель дважды 0,1 моляра HEPES с последующими двумя полосканиями с ультра чистой водой. Аспирировать избыток ультра чистой воды и использовать 200-микролитровую пипетку, чтобы покрыть гидрогель с 0,1 миллиграмма на миллилитр коллагена-1.
Обложка блюдо для защиты флуоресцентных бусин от фотоотбела и хранить гидрогель при четырех градусах по Цельсию на ночь. Теперь добавьте три миллилитров 1X трипсина в колбу и поместите его в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение трех-пяти минут, чтобы отделить клетки от колбы культуры тканей. После трипсинизации, добавить три миллилитров клеточной культуры средств массовой информации в колбу, вихрь, чтобы смешать, и передать смесь в 15-миллилитровую центрифугу трубки.
Центрифуга клеточного раствора в течение трех минут в 1, 710 раз G.Aspirate супернатант и повторно приостановить клетки в средствах массовой информации до концентрации 50 раз 10 до четырех клеток на миллилитр. Вынюхив гидрогель блюдо из холодильника. Удалить коллаген-1 из гидрогеля и промыть один раз с PBS.
Добавьте 75 раз 10 к третьим клеткам в верхней части трафарета PDMS и позвольте клеткам прикрепляться к поверхности гидрогеля в течение по крайней мере одного часа в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Удалите трафарет PDMS и погрузите трафарет PDMS в 10X трипсин в течение 10 до 15 секунд, чтобы удалить любые прикрепленные клетки. Добавить по крайней мере два миллилитров средств массовой информации в чашку Петри и стерилизовать трафарет путем распыления с 70% этанола, а затем размещение под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут.
Поместите чашку Петри в инкубатор, по крайней мере 36 часов, или до тех пор, пока слияние монослой наблюдается. Сравнивались фазовые контрастные изображения за 30 минут до лечения халконом и через два часа после лечения халконом. Клеточные перемещения бисера наблюдались для уменьшения как низких доз чалкона, так и высокодозных условий чалкона по сравнению с монослойными HUVEC.
До лечения chalcone, RMS тяги были около 51 Паскаль для всех условий. После лечения chalcone, было небольшое увеличение RMS тяги до 59 Паскаль в низких дозах chalcone лечение монослой и почти в два раза снижение RMS тяги до 18 Паскаль в высоких дозах chalcone лечение монослой по сравнению с контролем. Лечение Chalcone увеличило среднюю нормальную межклеточную величину стресса с низкой дозой, но значительно уменьшило среднюю нормальную межклеточную величину стресса с высокой дозой по сравнению с контролем.
Обработка chalcone также уменьшила максимальные отвесные межклеточные усилия на и низкой и высокой концентрации chalcone сравненной к управлению. Влияние лечения халкона является статистически значимым на основе как Т-тестов, так и одного фактора ANOVA теста. При размещении трафарета PDMS на верхней части геля, убедитесь, что гель достаточно сухой, чтобы обеспечить водонепроницаемый уплотнение между трафаретом PDMS и гель.
Этот протокол также может быть применен для зондирования биомеханического вклада различных клеточных соединений, цитоскелетных белков, молекул адгезии клеточной матрицы или внеклеточных молекул с живой визуализацией. С помощью этого протокола in vitro, исследователи теперь могут успешно исследовать множество биомеханических, а также биохимические свойства во время ремонта тканей, заживление ран, или метастазы рака без животной модели. Мы советуем нашим зрителям быть очень осторожными при обработке chalcone и DMSO, как вдыхание этих препаратов, как сообщается, вредно.
