Неоваскуляризация, генерация новых кровеносных сосудов является строго регулируемым процессом как в нормальных, так и в патологических явлениях. Чтобы лучше понять неоваскуляризацию, важно реконструировать процесс в естественной клеточной микросреду in vitro. Мы разработали микрофлюидный чип и автоматическое управление.
Высокоэффективные циркуляции делается для формирования перфузии микротрубок и имитации использования белка, чтобы повторить к первоначальному событию новой васкуляризации. Микрофлюидный прорастающий чип состоял из трех каналов. Эндотелиальный канал культуры клеток и жидкий канал были разделены широким центральным гидрогелевым каналом.
Система микрофлюидного управления состояла из микрохирургического насоса и электромагнитного клапана щепотки. Чип ловушки пузыря, микрофлюидный прорастающий чип, микроперистальный насос и культурный средний резервуар. С микрофлюидной системой эндотелиальные клетки могут стимулироваться высоким светимым стрессом стрижки, физиологическим уровнем трансендотелиального потока и различными сосудистыми эндотелиальными распределениями факторов роста одновременно.
Pipette 20 микролитр 125 микрограмм на миллилитр фибронектина в одном медиа-инъекционный порт канала клеточной культуры. Вырезать наконечник пипетки, чтобы соответствовать порту канала культуры клеток с ножницами. Вставьте наконечник пипетки в другой медиа-порт инъекций канала культуры клеток.
Затем, пипетка из воздуха из канала клеточной культуры, чтобы заполнить его фибронектином. Инкубировать чипсы при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Перед посевом клеток, пипетка 20 микролитер эндотелиальной среды ячейки в каждом порту впрыска средств массовой информации и инкубировать чипы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
Затем, pipette из всех средств массовой информации во всех портах впрыска средств массовой информации. Далее, пипетка пять микролитеров ячейки подвески в одном медиа-инъекционный порт канала культуры клеток. Затем эндотелиальные клетки быстро распространяются по всему каналу под дифференциальным гидростатическим давлением.
Добавьте от четырех до шести микролитров ECM-средств массовой информации в другой порт, чтобы отрегулировать гидростатическое давление и остановить перемещение клеток. Дистанционное чипы в клеточный инкубатор. Затем переворачивать чипы каждые 30 минут, пока эндотелиальные клетки не покрыть внутреннюю поверхность канала культуры клеток, два часа спустя.
Используйте наконечник пипетки, чтобы удалить прикрепленные ячейки в инъекционных портах очень тщательно. Затем вставьте четыре колючие женские адаптеры Luer в порты впрыска мультимедиа и заполните ecM-медиа. Удалите чипы в клеточный инкубатор, меняй экМ-медиа и адаптеры Luer каждые 12 часов.
Для сборки микрофлюидной системы управления подготовьем две полиэтиленовые трубки, две короткие силиконовые трубки, три длинные силиконовые трубки, одну колючую женскую адаптер Luer, один разъем типа Y, а затем три разъема типа L. Заполните шприц 10 миллилитров разогретой среды ECM. Подключите полиэтиленовую трубку к шприцу с помощью колючего женского адаптера Luer.
Затем соедините другой конец полиэтиленовой трубки с разъемом типа Y. Затем соедините две длинные силиконовые трубки с двумя другими концами разъема типа Y. Мы используем одну трубку для подключения к резервуару, а другая трубка для подключения к чипу ловушки пузыря.
Подключите другую длинную силиконовую трубку к резервуару. Далее используйте две короткие силиконовые трубки для подключения всех входных и выходных отверстий на верхнем слое чипа ловушки пузыря. Подключите полиэтиленовую трубку к бэкэнду чипа.
Затем зафиксировать шприц на микрохирург насоса. Зарезать две длинные силиконовые трубки в электромагнитный клапан щепотку. Затем переключитесь электромагнитный клапан щепотки, чтобы открыть трубопровод между шприцем и резервуаром.
Ввимите средства массовой информации в резервуар с помощью микрохирургного насоса для исчерпания воздуха в трубке. Затем снова переключитесь на клапан, чтобы открыть трубопровод между шприцем и чипом ловушки пузыря. Введать средства массовой информации для заполнения жидкой камеры и бэкэнд трубки чипа ловушки пузыря.
Вынюхив эндотелиальные прорастания чипов из клеточного инкубатора, а затем удалите адаптеры Luer со стороны клеточной культуры. Вставьте две трубы пробки в гидрогель инъекционных портов микрофлюидных прорастания чипа. Подключите бэк-энд трубку чипа ловушки пузыря к одному порту канала культуры клеток.
Вставьте разъем типа T в другой порт и соедините его с длинной кремниевой трубкой, подключенной к резервуару. Затмите длинную силиконовую трубку в микро перистальтический насос. Затем вставьте воздушный фильтр в резервуар.
Затем соберите микрофлюидный прорастающий чип в верхний инкубатор сцены. Затем подключите вакуумный насос к отверстиям в нижнем слое чипа пузырчатой ловушки с помощью трубки TPU. Установите противоположный объем циркуляции и скорость потока в пользовательской программе, которая контролирует микрохирургии насоса и электромагнитного клапана щепотку одновременно.
Далее, настроить скорость потока микро перистрального насоса. Включите микрохирург насос. Затем устанавливается система контроля циркуляции.
Мы тестируем барьерную функцию некоторых микро-сосудов в нашей модели, измеряя диффузный коэффициент проницаемости 40 kDa F-I-T-C dextrin. Как показано на рисунке, коэффициент диффузной проницаемости чипа статической культуры с клеточной подкладкой составляет 0,1 плюс-минус 0,3 микрометра в секунду. А коэффициент диффузной проницаемости пустого канала без подкладки ячейки составляет 5,4 плюс-минус 0,7 микрометра в секунду.
Эндотелиальный прорастания анализ показал, что эндотелиальные клетки проросли в центральный гидрогель в основном после 24 часов статического культивирования, в то время как степень прорастания значительно снизилась с увеличением светимого стресса стрижки. Количественно, светящийся стресс стрижки значительно уменьшился эндотелиального прорастания с точки зрения площади прорастания, средняя длина прорастания, и самая длинная длина ростка. С нашей системой, стрижка нагрузки на эндотелиальные клетки могут быть дополнительно изменены в любое время во время эксперимента в то время как трансендотелиальный поток остался на физиологическом уровне.
Эта биомиметическая модель in vitro 3D может быть непосредственно применена к изучению механизма неовасуляризации и имеет потенциальную перспективу в качестве недорогой платформы для скрининга лекарств и применения токсикологии.
