Ткани, используемые для иммуногистохимии и диагностической гистопатологии, обычно фиксируются в 10% фосфатном буферном формалине. Обнаружение антигена вируса бешенства в ткани мозга, который был зафиксирован в формалине, представляет собой уникальную проблему, и тест IHC оказался чувствительным и специфическим методом обнаружения антигена вируса бешенства. Основным преимуществом биопсии или других методов обнаружения является то, что антигены могут быть обнаружены по отношению к морфологии тканей и клеток.
С IHC локализация антигена бешенства в мозговых и немозговых тканях, обеспечивает дополнительную информацию, которую нельзя было получить с помощью рутинных пятен гематоксилина и эозина. Диагностическое тестирование на бешенство имеет важное значение для начала постэкспозиционной профилактики у людей, подвергшихся воздействию вируса бешенства. IHC является одним из наиболее часто выполняемых анализов на формалин-фиксированных тканях.
Со специфическими антителами его можно использовать для обнаружения соответствующих патогенов. Чтобы начать эту процедуру, поместите от трех до пяти миллиметров кусочков мозговой ткани, собранных после некропсии, в 10% буферный раствор формалина на 24-72 часа. Запишите приблизительный вес ткани, тип ткани и объем формалина.
Поместите ткани в 70% этанол для более длительного хранения тканей после фиксации формалина и перед обработкой. После фиксации образца рассекните ткань, чтобы включить важные области мозга, такие как поперечные сечения ствола мозга, мозжечок или гиппокамп. Каждый из них разрезают до толщины от трех до пяти миллиметров.
Поместите ткани в кассеты для обработки. Обработать тканевые кассеты для инфильтрации парафиновым воском. Вставьте их в парафиновые блоки и разделите на микротом.
Сначала настройте окрашивающую посуду, как показано на рисунке 1 текстового протокола. Наполните каждое блюдо 250 миллилитрами приготовленного раствора. Для приготовления раствора субстрата AEC используют стеклянную пипетку, чтобы растворить одну 20-миллиграммовую таблетку AEC в 5 миллилитрах N,N-диметилформамида.
Для приготовления раствора протеазы растворите 7 миллиграммов протеазы в 200 миллилитрах PBS. Чтобы подготовить буфер промывки, добавьте 100 миллилитров Tween от 80 до 990 миллилитров PBS и хорошо перемешайте, чтобы образовался однородный раствор PBT-T. Используя микротом, сделайте пятимикрометровое парафиновое сечение.
Загрузите секцию на водяную баню при 38 градусах Цельсия и соберите ее на стеклянные горки. Пометьте слайды ручкой, устойчивой к реагентам. Поместите горки на лоток и расплавите в духовке при температуре от 55 до 60 градусов Цельсия в течение одного часа.
Затем достаньте слайды из духовки и сразу же депарафинизируйте их, используя 3 последовательных ксилоловых ополаскивающих по 5 минут каждая. После этого регидратируют участки на слайде путем последовательного погружения в уменьшающееся разбавление этанола в деионизированную воду, как указано в тексте протокола. Обработайте слайды протеазой в течение 30 минут для извлечения протеолитического антигена, затем промойте слайды в PBS-T в течение 10 минут и обработайте их 3% перекисью водорода в течение 10 минут.
После этого снова помойте слайды PBS-T в течение 10 минут. Для начала удалите один слайд из буфера, убедившись, что обрабатывается только один слайд за раз, в то время как другие остаются погруженными, и используйте бумажное полотенце, чтобы смыть лишний буфер с участка ткани. Поместите горки в камеру влажности и инкубировать с обычной козьей сывороткой при комнатной температуре в течение 15 минут.
Затем инкубируют слайды в камере влажности с оптимальным предопределенным разведением первичных антирабовых антител и отрицательных контрольных антител при комнатной температуре в течение 60 минут без стирок между ними. После этого промыть горки PBS-T в течение 10 минут и инкубировать в камере влажности с биотинилированным антителом при комнатной температуре в течение 15 минут. Снова вымойте слайды PBS-T в течение 10 минут.
Инкубировать горки и влагообойку с разделителем полос и комплексом HRB при комнатной температуре в течение 15 минут и промыть PBS-T в течение 10 минут. Затем инкубировать с AEC в камере влажности при комнатной температуре в течение 10 минут. Промыть горки в деионизированной воде в течение 10 минут и смазывать гематосилином Гилла, разбавляя один-два деионизированной водой в течение двух минут.
После этого смойте избыток гематоксилина, окунув горки в деионизированную воду. Промойте горки в водопроводной воде Скотта в течение 30 секунд и промойте в деионизированной воде в течение 10 минут. Снимите горки по одному и установите их водорастворимым монтажным носителем.
Затем используйте световой микроскоп для чтения слайдов. В этом исследовании продемонстрирован иммуноцитарный химический тест для обнаружения антигена вируса бешенства в качестве альтернативного диагностического теста для тканей, фиксированных формалином. Здесь показан репрезентативный результат окрашивания иммуноцитарной химии положительных и отрицательных контрольных образцов в различных тканях мозга, включая ствол мозга, клетки мозжечка и пуркинье, а также гиппокамп.
Пурпурно-красное окрашивание, которое указывает на развитие цвета при использовании субстрата AEC на синем контрокрашенном фоне, обусловлено реактивностью антител против антигена бешенства. Положительный результат в иммуногистохимии соответствует пурпурно-красному окрашиванию в срезах тканей. Окрашивание цитоплазматических включений и зернистых включений различного размера свидетельствует о положительных образцах на RABV-инфекции.
Образцы считаются отрицательными, если не наблюдалось специфического красного окрашивания или только синий фон из-за гематоксилина. В дополнение к положительному окрашиванию, распределение включений может обеспечить косвенную количественную оценку уровней антигена бешенства в образце, что может соответствовать вирусной нагрузке образца ткани. Независимо от уровней распределения, любое конкретное окрашивание будет классифицировать образец как положительный для обнаружения антигена RABV.
Ткани должны быть адекватно зафиксированы в формалине, и избегать замораживания тканей во время этого процесса. Антиген бешенства обнаруживается IHC, затем молекулярные методы могут быть выполнены на парафиновых участках для определения варианта лиссавируса на основе информации о последовательности РНК. Реагенты, такие как ксилол и формалин, должны обрабатываться в вытяжных вытяжках.
Следует проявлять осторожность при обращении с AEC, так как это канцероген.
