Этот RT-PCR в режиме реального времени подходит для быстрой диагностики бешенства в образцах при вскрытии и вскрытии. Праймеры Pan-Lyssavirus были оптимизированы для идентификации всех представителей рода лиссавирусов. Это быстрый, чувствительный и закрытый анализ, который обнаруживает вирусы со всего рода лиссавирусов, включая сильно расходящиеся виды из клинических образцов.
МВЕ недавно принял молекулярные анализы, чтобы сообщить о бешенстве инфекции. Это особенно важно для разложившихся образцов, которые не всегда могут быть диагностированы с помощью вирусной культуры или методов обнаружения антигенов. Из-за чувствительности этого анализа, хорошая лабораторная практика, включая разделение различных этапов имеет жизненно важное значение для минимизации риска заражения.
Демонстрацией процедуры будет Дейзи Дженнингс, диагност из моей лаборатории. Начните с количественной оценки РНК с микро-спектрофотометром объема. Убедитесь, что машина настроена на РНК и использовать один-два микролитера молекулярного класса воды для нормализации машины и создания базовой линии.
Измерьте концентрацию РНК и отрегулируйте ее до одного микрограмма на микролитер. Запланируйте макет ПЦР-пластины с помощью электронной таблицы с учетом как тестовых, так и контрольных образцов. Подготовьте рабочую станцию ПЦР путем дезинфекции поверхностей и при использовании УФ-кабинета включите ультрафиолетовый свет за 10 минут до запуска.
Удалите реагенты и грунтовки из морозильной камеры, чтобы оттаять, но держать фермент смесь на льду во все времена. Смешайте реагенты и центрифугу кратко, чтобы собрать жидкость. Подготовка ПЦР мастер смеси для лиссавируса и бета-актина в соответствии с рукописными указаниями.
Оставьте мастер смеси на льду до готовности к использованию. Смешайте и центрифуга подготовленные мастер смеси и обойтись 19 микролитров в соответствующие скважины ПЦР машины совместимы пластины или трубки полосы. В отдельную комнату или УФ-кабинет аккуратно добавьте один микролитер подготовленной РНК.
При использовании УФ-кабинета включите ультрафиолетовый свет за 10 минут до запуска. После тестовых образцов добавьте положительный контроль и отсутствие контроля шаблонов. При добавлении РНК в мастер смеси, убедитесь, что он добавлен в правильный колодец.
Используйте план пластины, чтобы помочь этому шагу. Печать пластины проверки, что крышки плоские по всей пластине и спина его вниз, чтобы собрать всю жидкость в нижней части скважин. Убедитесь, что каждая колодец имеет одинаковый объем жидкости и пузырьков не видно.
Затем перенесите образцы на машину ПЦР. Откройте программу выбора SYBR Green с диссоциацией. Выберите скважины для анализа, выбрав неизвестный тип образца и SYBR в качестве флуоресцентного красителя.
Этикетка скважин на макете пластины с информацией образца в том числе ли анализ для лиссавируса L или бета-актина. Нажмите на настройку термопрофили и измените условия теплового цикла, указанные в рукописи. Нажмите кнопку «Начать», затем выберите место для сохранения файла и проверьте коробку, чтобы выключить лампу в конце запуска.
Когда появится возможность начать разминку перед разминкой лампы, нажмите кнопку запустить сейчас, но убедитесь, что лампа имеет менее 15 минут, чтобы согреться. После завершения запуска PCR приступить к анализу данных. Сначала проанализируйте участки усиления лиссавируса.
Положительные образцы отображают экспоненциальные пандусы, в то время как отрицательные образцы имеют плоские участки усиления без значений КТ. Затем проанализируйте результаты кривой диссоциации лиссавируса образцов теста вместе с контрольными образцами. Положительный образец лиссавируса будет иметь температуру плавления между 77 и 80 градусов по Цельсию и перекрытия с положительным контролем.
Далее проанализируйте участки усиления бета-актина и кривые диссоциации по сравнению с элементами управления для интерпретации общего результата. Просмотр текстового отчета и использование деталей для записи значений CT и TM, полученных для контрольной РНК в контрольной карте, чтобы подтвердить, что запуск был успешным и что результаты тестового образца могут быть сообщены. Этот протокол используется для демонстрации чувствительности Pan-Lyssavirus RT-PCR на серии разбавления РНК стандартного вируса.
Кривая усиления указывает на то, что всего 10 пикограмм лиссавируса могут быть обнаружены и кривые диссоциации проверить температуру плавления продукта. Температура плавления используется для подтверждения того, что ампликон является лиссавирус специфическим. Результаты здесь демонстрируют диапазон температур плавления в роду лиссавирусов от 77,34 до 79,67 градусов по Цельсию.
Значения температуры плавления ниже 76,8 или выше 80,2 считаются неспецифическими. Чувствительность этого анализа RT-PCR также определяется путем обнаружения РНК из трех лиссавирусных положительных образцов мозга. Всего 0,1 пикограммы на микролитер целевой РНК могут быть обнаружены для двух из трех образцов.
Примечательно, что с помощью этого анализа выявлены представители всех признанных видов лиссавирусов. При анализе РНК-экстрактов из клинических образцов, таких как слюна или CSF, бета-актин результаты могут быть отрицательными из-за отсутствия нуклеиновых кислот хозяина. Добавление экзогенного контроля может решить эту проблему.
Секвенирование положительных образцов лиссавируса рекомендуется предоставить дополнительную информацию о географическом и принимающем происхождении инфекции бешенства. Обработка лиссавирусных положительных или предполагаемых положительных проб должна соответствовать местным рекомендациям в отношении здоровья и безопасности. Извлеченная РНК не является инфекционной, поэтому может быть обработана в лабораториях с низким содержанием сдерживания.
