Мы представляем патологию расширения, или ExPath для краткости, низкой стоимости измерения изображения биомолекулы интерес в стандартных клинических секций тканей, с наномасштабной точностью. ExPath обходит предел дифракции обычной световой микроскопии, химически вливая клиническую секцию ткани с водяным набухающим гидрогелем, а затем физически и равномерно расширяя обработанные образцы примерно в сто раз, позволяя ранее перекрываемым флуоресцентно помеченным биомолекулам отделяться и наблюдаться с помощью обычного оптического микроскопа. ExPath позволяет пользователям изучать наномасштабные конфигурации биомолекул, связанных с болезнями, в образцах тканей без необходимости вкладывать средства в новое оборудование для визуализации.
Таким образом, что позволяет новые идеи болезни и содействия новой диагностики. Этот метод может быть применен к широкому спектру типов тканей и использоваться для получения нового понимания патогенеза различных сложных заболеваний, таких как рак, болезни мозга, аутоиммунные заболевания и другие. Визуальная демонстрация важна, чтобы проиллюстрировать, как сделать критические шаги должным образом, такие как строительство камеры мерин и обработки гелеобразного образца до и после пищеварения Proteinase K.
Начните с преобразования ткани, представляющих интерес, в совместимый формат ExPath. При работе с клиническими образцами FFPE поместите слайд с образцом в 50 мл конической трубки и добавьте 15 мл зилена. Крышка трубки и поместите его горизонтально на орбитальный шейкер примерно в 60 об/мин в течение трех минут.
Повторите стирку еще 15 мл Зилена. Затем вымойте слайд в серии разбавлений этанола, в соответствии с рукописными указаниями. Если вы работаете с окрашенными и установленными постоянными слайдами, поместите каждый слайд в коническую трубку 50 мл, а затем накройте его зиленом.
Аккуратно снимите крышку скольжения с лезвием бритвы. Затем обработать слайд так же, как клинические образцы FFPE. Если вы работаете с нефиксированными замороженными слайдами ткани в растворе OCT, зафиксните ткань в ацетоне при 20 градусах по Цельсию в течение десяти минут, затем промойте образцы раствором 1X PBS три раза в течение десяти минут за стирку.
Если обработка ранее фиксированных и замороженных клинических образцов, оставить слайды в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы расплавить внебиржевой раствор, а затем мыть образец с 1X PBS три раза, в течение пяти минут за стирку. После преобразования формата выполните поиск антигена на всех образцах. Нагрейте 20 миллимолейных цитратовую раствор до 100 градусов по Цельсию в микроволновой печи и поместите слайд в раствор.
Немедленно перенесите контейнер в инкубационую камеру и инкубировать его при 60 градусах по Цельсию в течение тридцати минут. Чтобы испачкать образец, используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать границу вокруг секции ткани на слайде. Поместите слайд в чашку Петри, затем инкубировать ткани с блокирующим буфером в течение одного часа при 30 градусах по Цельсию.
Затем инкубировать ткани с первичным раствором антитела, по крайней мере три часа при комнатной температуре или 37 градусов по Цельсию. После инкубации, мыть ткани три раза с блокирующим буфером, и инкубировать его во вторичном растворе антитела, по крайней мере один час при комнатной температуре, или 37 градусов по Цельсию. Повторите мойки с блокирующим буфером, затем выполните флуоресцентную визуализацию, используя обычный широко полевой микроскоп или другую систему визуализации по выбору.
Подготовь якорное решение в соответствии с рукописными инструкциями. Поместите горки в чашку Петри 100 мл, завяйте якорный раствор над тканью и инкубировать их в течение по крайней мере трех часов при комнатной температуре. Затем подготовь решение для выгеля в соответствии с рукописными указаниями.
Удалите избыток якорного раствора из секции ткани и поместите слайд обратно в чашку Петри. Добавьте свежий холодный мерин раствор в образец и инкубировать смесь в течение тридцати минут, при четырех градусах по Цельсию. Чтобы построить камеру на слайде вокруг образца, создайте спейсеры, тонко разрезая кусочки крышки стекла алмазным ножом.
Защистите проемы по обе стороны ткани водой и аккуратно поместите крышку крышки крышки над горкой, убедившись, что избежать захвата пузырьков воздуха над тканью. Затем инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию во влажной среде в течение двух часов. Снимите крышку камеры мерин, аккуратно сдвинув лезвие бритвы под крышкой и медленно поднимая его с поверхности геля.
Обрезать пустой гель вокруг ткани, чтобы свести к минимуму объем, убедившись, что сократить гель асимметрично отслеживать ориентацию. Разбавить Proteinase K от одной до двухсот в буфер пищеварения, убедившись, что подготовить достаточное решение, чтобы полностью погрузить гель. Затем инкубировать образец раствором в закрытом контейнере в течение трех часов при 60 градусах по Цельсию.
Если образец не отделяется во время пищеварения, используйте лезвие бритвы, чтобы аккуратно удалить его. Используйте мягкую кисть для передачи образца в 1X PBS в контейнере, совместимом с желаемой системой визуализации и достаточно большом для размещения полностью расширенного геля. Вымойте образец в PBS в течение десяти минут и при желании переутомите его 300 миллимолярдом DAPI.
Расширьте образцы путем мытья образца с избыточным объемом двойной дистиллированной воды три-пять раз в течение десяти минут за стирку. Затем выполняем флуоресценцию. Если этот протокол выполняется успешно, образцы появляются как плоский и прозрачный гель после механической гомогенизации и может расширяться в 3-4,5 раза в воде.
Образец почки FFPE толщиной в пять микрометров был расширен в 4,5 раза, в результате чего разрешение составило 63 нанометров с использованием цели 0,95 н.е. Ткань затем была преобразована в расширение патологии совместимый формат и окрашенные антителами для Альфа Актинин 4 и Vimentin, DAPI для визуализации ядерной ДНК, и пшеница Germa Glutenin для обозначения углеводов. Для изображения образца затем использовалась конфокальцированная микроскопия спиннингового диска.
Затем почечная ткань была полностью расширена в воде и снова изображена. Крекинг, искажения и потеря помеченных целей могут быть результатом недостаточной закрепления или гомогенизации. Гематоксилин и эозин окрашенных нормальной ткани молочной железы рассматривается как образец FFPE, расширенный, помечены DAPI, и изображены на вращающемся диске конфокального микроскопа.
Нефиксированные и замороженные ломтики почек также были обработаны с помощью этого протокола. Ткань была зафиксирована в холодном ацетоне и окрашена альфа-актинином 4, виментином, DAPI и пшеничной гермой Глюнин. При выполнении этого метода, важно помнить, сроки шага геля имеет решающее значение.
Преждевременное гелеобразование может вызвать искажения, ограничить расширение и привести к потере молекул-мишеней. После этой процедуры флуоресцентная визуализация может быть выполнена на микроскопе после пищеварения и расширения образца. ExPath может быть широко применен как в патологиях, так и за его пределами.
Как это позволяет исследователям визуализировать тонкие детали в образцах тканей, представляющих интерес. Таким образом, это может помочь исследователям получить новые идеи в патогенеза заболеваний или механизмов биологических процессов.
