Витрификация, как правило, обрабатываются токсичности криопротекторных агентов. И вновь вставляется в небольшие образцы, которые можно быстро охлаждать. Этот протокол позволяет витрификации больших количеств клеток при использовании низкой концентрации CPA во время предварительной инкубации.
Используя быстрое осмотическое обезвоживание, низкий межпо погреб CPA концентрируется в жидкости устройства непосредственно перед витрификации. Это устраняет необходимость полного уравночения токсичных концентраций CPA. Массовая витрификация капель может обеспечить жизнеспособные и метаболически активные гепатоциты для использования трансплантации гепатоцитов и био-искусственных устройств печени, которым в настоящее время препятствуют неадекватные результаты после криоконсервации.
Этот метод потенциально может быть адаптирован для витрификации других типов клеток, которые должны быть крио-сохранены в больших количествах; таких как продукты крови или стволовые клетки среди других. Для начала сделайте витрификационое решение 1, добавив 40 миллиграммов BSA к 17,0 миллилитров решения Университета Висконсина. Используйте фильтр 0,22 микрометра для стерильного фильтра раствора и хранения при четырех градусах Цельсия.
Сделать витрификации Решение 2, как описано в протоколе. И стерильный фильтр его через фильтр 0,22 микрометра. Загрузите 3,5 миллилитров стерильного фильтрованного раствора V2 в трехми миллилитровый шприц и храните при четырех градусах Цельсия.
Для подготовки навалом капельки витрификации аппарата, во-первых, вырезать вдоль одной стороны смешивания иглы наружного серого рукава. Согните рукав открытым, чтобы удалить его из смешивания иглы. Затем вырежьте смешивание иглы до длины 20 миллиметров и вставьте его выход отсечения в 20 калибровочных иглы инъекций.
Сдвиньте две 25-миллиметровые секции кремниевых труб над входами смешивания иглы. И закрет их положение клеем. Стерилизовать эту сборку путем автоклавинга.
Заполните стерильную колбу Dewar жидким азотом. И стерилизовать снаружи с изопропанолом, прежде чем поместить его в стерильный Laminer поток-клеток культуры капот. Убедитесь в том, чтобы носить соответствующие средства индивидуальной защиты, как жидкий азот может вызвать серьезные ожоги.
Для создания устройства сбора капель вставьте воронку с тем же внешним диаметром, что и внутренний диаметр Дьюара, в коническую трубку диаметром 50 миллилитров. Используя большие типсы, медленно нажимайте устройство сбора капель вниз в жидком азоте в его окончательном вертикальном положении. Убедитесь, что коническая трубка лежит в вертикальном положении в нижней части двойки.
А уровень жидкого азота на один сантиметр ниже края воронки. Чтобы смонтировать шприц-насос в вертикальном положении на стене капота клеточной культуры, свяжите веревку с ног шприц-насоса до винтов, выступающих от стенки капота клеточной культуры. Затем поместите жидкий азот Dewar с устройством сбора капель под вертикально установленный шприц насос.
После получения свежеисключенные гепатоциты крысы, подсчитайте концентрацию запасов три-пан синий исключение. И перенесите 40 миллионов жизнеспособных гепатоцитов в 50 миллилитровую коническую трубку. Центрифуга гепатоцитов в 50 раз G в течение пяти минут без перерыва.
Аспирировать супернатанта. Повторно приостанавливать гепатоциты в 3,4 миллилитров V1 Solution. И инкубировать на льду в течение трех минут.
Затем добавьте 150 микролитров DMSO и 150 микролитров EG;смешайте аккуратно и снова инкубировать на льду в течение трех минут. Добавьте 150 микролитров DMSO и 150 микролитров EG в гепатоциты снова и аккуратно перемешайте. Загрузите 3,5 миллилитров этой смеси в трехми миллилитровый шприц.
Вставьте шприц с предварительно инкубированными гепатоцитами и шприц с раствором V2 на адаптер насоса шприца. Прикрепите к шприцам два женских шланга Luer Lock- barb. И сдвиньте кремниевые трубки смешивания иглы сборки над колючкой фитинги.
Поместите всю эту сборку в шприц-насос. Через три минуты после последнего выпуска DMSO и EG к гепатоцитам, запустите насос в два миллилитров в минуту. Ведь гепатоциты были добавлены в жидкий азот остановить насос.
Используя 20 калибровочных игл, прокол 10 небольших отверстий в крышке 50 миллилитров конической трубки. И оберните внешнюю часть крышки гибкой пленкой, создавая клапан, который позволит избежать испарения осталась за жидким азотом. Чтобы собрать витрифицированные капли гепатоцитов, сначала удалите воронку из двойки жидким азотом.
Затем, с длинными типсами, вывихите коническую трубку, которая содержит капли из жидкого азота, и медленно вылейте избыток жидкого азота из конической трубки. Закройте коническую трубку проколотой крышкой, а затем непосредственно поместите закрытую коническую трубку с витифицированными каплями гепатоцитов обратно в Дьюар с жидким азотом. Наконец, перенесите коническую трубку из жидкого азота в жидкий азот криотанк.
После внесения повторного раствора с сахарозой и DMEM гепатоцитов культуры средств массовой информации, использовать 0,22 микрометровый фильтр для стерильного фильтра его. Затем разогреть до 37 градусов по Цельсию. Чтобы напомнить гепатоциты удалить коническую трубку с витифицированными гепатоцитами из криотанка и транспортировать его в жидком азоте Dewar в субкультуру капот.
Слегка ослабьте крышку и поместите коническую трубку обратно в жидкий азот. Работая быстро, добавьте все vitrified капли гепатоцитов в пустой стакан, а затем быстро добавить 100 миллилитров 37 градусов по Цельсию теплого раствора разогрева при перемешивании в течение 10 секунд. Когда капли удаляются из жидкого азота внутриэфирной замораживания происходит в течение нескольких секунд, если капли не быстро rewarmed.
Поэтому крайне важно напрямую добавить в капли разовящиеся средства массовой информации, помешивая. Разделите раствор с гепатоцитами на две 50 миллилитровые конические трубки. Центрифуга труб в течение двух минут при 100 раз G при четырех градусах цельсия без перерыва.
Аспирировать supernatants оставить общий объем 12,5 миллилитров, используя выпускной знак трубки в качестве эталона. Для разбавления раствора rewarming до 50%добавляют 12,5 миллилитров ледяного DMEM на коническую трубку. Повторно приостанавливать и инкубировать на льду в течение трех минут.
Для разбавления повторного раствора до 25%добавляют 25 миллилитров ледяного DMEM на коническую трубку. После центрифугирования в течение пяти минут при 50 градусах G при четырех градусах Цельсия без перерыва, аспирировать супернатант и повторно приостановить гепатоциты в двух миллилитров желаемой среды культуры. При измерении три-пан синий тестирования исключения, который определяет целостность мембраны, навалом витрификации капель привело к прямой пост-сохранения гепатоцитов жизнеспособности 79%Это было значительно выше, чем 68%жизнеспособности после классической оптимизированной криоконсервации.
Доходность витрификации сыпучих капель составила 56%, что на 10% выше и последовательнее классического криоконсервации. Использование престо-клей метаболизации анализ в долгосрочном колледже и сэндвич культур, метаболическая активность в гепатоцитов было измерено, чтобы быть значительно выше после витрификации навалом капель, то после классического криоконсервации. Синтез альбумин, как наиболее широко используемый параметр синтетической функции гепатоцитов, был больше почти в два раза после массовой витрификации капель, затем после классического криоконсервации.
Производство мочевины использовалось для измерения функции детоксикации гепатоцитов в недельной культуре. В навалом капли vitrified гепатоцитов, производство мочевины было значительно выше, чем в классических криопресервных гепатоцитов. Для последовательных результатов после массовой витрификации капель важно точно следить за сроками во время предварительной инкубации CPAs и rewarming как подробно описано в этом протоколе.
После повторного развооружения vitrified капли гепатоцитов вы в конечном итоге с лучшей подвеской размеров, которые поэтому могут быть использованы во всех же способов, как если бы они были недавно изолированы. В качестве улучшенного метода сохранения, витрификация навалом капель может увеличить доступность pri-ma для исследований и клинического применения.
