Этот протокол описывает метод, который ориентирован на извлечение параллельно двух наиболее распространенных популяций глиальных клеток, астроцитов и микроглии, от постнатальных мышей. Наш метод отличается от других ранее описанных протоколов изоляции астроцитов и микроглий, потому что мы фокусируемся на получении и изоляции обоих типов клеток в одном и том же состоянии, тем самым оптимизируя использование экспериментальных животных и улучшая изучение относительных ролей этих клеток в иммунологических контекстах. Этот протокол может быть полезен для лучшего исследования микроглии и астроцитов роли во многих контекстах и заболеваний в центральной нервной системе, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсон, и инфекций, например, простейших паразитов или вирусов.
Получение и изоляция обоих типов клеток от одной и той же экстракции желательно для оценки сравнительной роли каждой клетки подмножества иммунологических контекстах, таких как инфекция или воспаление. Люди должны быть осторожны, особенно во время удаления мозга и нервной ткани моет, но я считаю, что с этим протоколом и видео выстрел, люди не будут бороться. Этот протокол может быть длинным в зависимости от количества животных, чтобы извлечь кортики, поэтому будьте готовы потратить около четырех часов или более.
В первый день приготовьте чистые HBSS и HBSS плюс 10% тепла инактивированных FBS. Приготовьте дополненный DMEM F12 и отфильтруните его фильтром 0,22 микрона. Стерилизовать все хирургические инструменты в автоклаве и использовать 70% этанола во время процедуры.
Положите новорожденных мышей в запечатанную камеру, содержащую хлопок, пропитанный изофлюраном в течение пяти минут для глубокой анестезии. Спрей мыши щенка с 70%этанола и обезглавить животное с ножницами. Сделать sagittal вырезать ножницами вдоль черепа, чтобы открыть его и разоблачить мозг.
Удалите мозг с помощью микро шпателя для поддержания целостности мозга. Поместите мозг в сухую шестиметровую чашку Петри диаметром шесть сантиметров. С помощью микро шпателя удалите обонятельную лампу и мозжечок.
Перемести кору в другую чашку Петри, содержащую два миллилитров HBSS плюс 10%FBS. Разрежьте ткани мозга на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц и с помощью микропипюты P1000, передать каждую ткань мозга с HBSS плюс 10%FBS в различных 15 миллилитров конических труб. При необходимости используйте HBSS плюс 10%FBS для заполнения конечного объема до двух миллилитров.
Вымойте разрез ткани мозга с тремя миллилитров HBSS плюс 10%FBS для каждой трубки. После декантации аккуратно удалите супернатант. Повторите стирку с HBSS плюс 10%FBS три дополнительных раза.
Затем мыть с тремя миллилитров чистого HBSS в три раза. После декантации аккуратно удалите супернатант. Затем добавьте три миллилитров трипсина и поместите трубку в ванну с водой при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, нежно встряхивая трубки каждые пять минут.
Это переваривает собранную ткань. Избегайте пузырей. Чтобы инактивировать трипсин, промыть ткань тремя миллилитров HBSS плюс 10%FBS и после декантации ткани, тщательно удалить супернатант.
Повторите эту стирку три раза. Затем промыть ткань тремя миллилитров чистого HBSS и повторить два дополнительных раза. После декантации ткани, тщательно удалить супернатант.
Добавить семь миллилитров чистого HBSS и гомогенизировать ткани через последовательные проходы в пипетки, сначала с 10 миллилитров серологического пипетки, а затем пять миллилитров пипетки, и, наконец, с P1000 микропипец. После гомогенизации центрифуга труб при 450 раз g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы с четырьмя миллилитров HBSS плюс 10%FBS для каждой трубки.
Перенесите клетки в коммерчески предварительно обработаемую колбу T75 для оптимального адгезии клеточной культуры. Поместите колбу в инкубатор при 37 градусах Цельсия при 5%углеродном диоксиде в течение 30 минут для присоединения. Затем добавьте 10 миллилитров дополненного DMEM F12 в колбу и инкубировать при 37 градусах по Цельсию и 5% углекислого газа в течение двух ночей.
На третий день снимите семь миллилитров культурной среды из колбы T75 и добавьте семь миллилитров свежей дополненной DMEM F12. Верните колбу в инкубатор. На пятый день, чтобы удалить мусор и неадхенерентные клетки, обмен все среды из колбы T75 с 14 миллилитров свежих дополненных DMEM F12.
Затем каждые 48 часов, удалить шесть миллилитров супернатанта и добавить семь миллилитров свежих дополненных DMEM F12 среды до 14-го дня культуры. На 14-й день, после удаления шести миллилитров супернатанта и добавления семи миллилитров свежеприготовляемой DMEM F12 среды, закройте колбы T75 плотно пластиковой упаковкой. Поместите их в пол орбитального шейкера на 200 об /мин и 37 градусов по Цельсию в одночасье механически отмежеваться микроглии от астроцитов.
На 15 день возьмите колбы из шейкера и энергично мыть их с их собственной среде, с тем чтобы оптимизировать диссоциацию клеток и собрать максимальное количество микроглии. Затем соберите супернатант и перенесите его в коническую трубку на 50 миллилитров. Затем добавьте четыре миллилитров трипсина в каждую колбу и инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию, чтобы отделить астроциты.
Затем добавьте пять миллилитров дополненного DMEM F12 для инактивации трипсина. Вымойте колбы с их собственной среде и передать содержимое в 50 миллилитров конической трубки. Центрифуга всех трубок, содержащих диссоциированные микроглии или астроцитов в 450 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
Откажитесь от супернатанта. Resuspend гранулы микроглии в один миллилитр дополненных DMEM F12 и астроцитов в 10 миллилитров дополненных DMEM F12. Приступайте к подсчету ячеек в камере Neubauer или автоматической счетчике ячейки.
Плита клетки с дополнительной DMEM F12 при желаемой плотности в предварительной плоской нижней пластины культуры клеток. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 24 часов, чтобы позволить им прикрепиться. На 14-й день культура глиальных клеток подверглась механической диссоциации.
Наблюдалось с чистотой 89,5% для популяции астроцитов и 96,6% для населения микроглии. Астроциты и микроглии от C57BL6 мышей были инфицированы T.cruzi Y.После двух часов, 48 часов и 96 часов, камеры были зафиксированы метанолом и окрашены маркером ядра клеток DAPI и анти-GFAP. Использование генетически модифицированных паразитов, выражаюющих флуоресцентные репортеры или паразитов, помеченных специфическими флуоресцентными антителами, улучшило микроскопию иммунофлуоресценции, поскольку они лучше отличаются от ядра клетки.
Здесь представлены два примера. Штамм T.gondii RH, составляющий YFP и штамм T.cruzi Y, окрашенный некоммерческим моноклональным антителом 2C2 анти-SSP4 белка. Важно тщательно промыть клетки, чтобы не потерять никаких клеточных агрегатов.
После инфекции глиальных клеток, другие параметры могут быть оценены, такие как ELISA для производства цитокинов, присутствующих в супернатант, западные blotting для экспрессии белка, и в режиме реального времени количественные ПЦР для оценки транскрипции РНК. Многие вопросы, связанные с функцией глиальных клеток, например, их метаболизм, иммунный ответ, и клеточной биологии себя могут быть решены и выгоду от этой техники. Все паразиты простейших способны инфицировать клетки человека, а также клетки мыши культуры, поэтому важно быть осторожным при обращении с этим паразитом.
