ВИЧ-инфекция вызывает иммунную дисфункцию даже у лиц, проходящих антиретровирусную терапию без обнаруженного вируса. Этот метод позволяет изучать функции моноцитов, которые являются ключевыми регуляторами иммунного ответа. Мы оптимизировали этот метод для изоляции, культуры и трансфекции первичных моноцитов человека.
Мы используем этот метод, чтобы понять молекулярные механизмы иммунной дисфункции у ВИЧ-инфицированных людей, но он может быть применен к любым другим иммунным исследованиям с участием моноцитов. Если вы впервые работаете с человеческой кровью, не забудьте следовать надлежащим протоколам биобезопасности и рассматривать все образцы как возможно инфекционный материал. После сбора 40 миллилитров свежей человеческой цельной крови в четырех 10 миллилитров EDTA вакуумных трубок, использовать стерильную технику для передачи всей крови в один 50 миллилитров конического пропилена трубки в биобезопасности кабинета.
Следуя инструкциям производителя из выбранного человека комплект изоляции моноцитов, добавить два миллилитров моноцитов изоляции коктейль из комплекта в трубку крови и вихрь магнитных бусин из комплекта в течение 30 секунд. Добавьте в кровь два миллилитров бисера и используйте серологическую пипету на 25 миллилитров, чтобы тщательно смешать бисер с кровью. После пяти минут при комнатной температуре, разделить кровь поровну между четырьмя 50 миллилитров трубки и добавить 30 миллилитров стерильных PBS дополняется одним миллимолярной ЭДТА для каждой трубки.
Снова смешайте с пластиковой 25 миллилитров серологической пипетки и поместите трубки в магнитных держателей. Через 10 минут используйте пипетку, чтобы составить содержимое из центра каждой трубки, заботясь, чтобы не аспирировать более одного миллилитра красных кровяных телец и распределить содержимое трубки в одну из четырех новых 50 миллилитров труб. Добавьте 500 дополнительных микролитров вихревых магнитных бусин к каждой трубке и аккуратно смешайте клеточный раствор.
Поместите трубки обратно в магнитные держатели в течение пяти минут, прежде чем тщательно передавать содержимое из центра каждой трубки в одну из четырех новых 50 миллилитров труб. Когда все подвески клетки были перенесены, поместите каждую новую 50-миллилитровую трубку в магнитные держатели в течение пяти минут, прежде чем тщательно перенести содержимое трубки в третий набор из четырех новых 50 миллилитров труб. Затем соберите клетки путем центрифугации и повторно посовечите все четыре клеточные гранулы в общей сложности 10 миллилитров стерильных PBS для подсчета.
После подсчета, resuspend изолированных моноцитов в один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр 37 градусов по Цельсию сыворотки свободной RPMI 1640 среды дополняется антибиотиками и пластины один миллилитр resuspended клеток в 35 миллиметров пластин в биобезопасности кабинета. Затем поместите пластины в инкубатор культуры клеток на 30-60 минут, чтобы клетки придерживались дна. Чтобы загрунтовывать макрофаги с фенотипом M1, добавьте 100 микролитров сыворотки крупного рогатого скота плода, содержащей 25 нанограмм на миллилитр ГМ-CSF к каждой пластине.
Чтобы загрунтовывать макрофаги с фенотипом M2, добавьте 100 микролитров крупного рогатого скота плода, содержащих 50 нанограмм на миллилитр M-CSF к каждой пластине. Для моноцитов трансфекции с микроРНК имитирует, ингибиторы, или небольшой вмешательства РНК, следуя протоколу производителя для трансфекции комплект, разбавить выбранных РНК в буфере до конечной концентрации 1,83 микромолара в 10 микролитров разбавленной имитации или ингибитора на трансфекцию один раз от 10 до пятого объема клеток. Чтобы подготовить трансфектальный реагент, добавьте один микролитр предоставленного полимера в 1,5 миллилитровую микроцентрифуговую трубку и немедленно добавьте 90 микролитров буфера, предоставленного комплектом, чтобы получить в общей сложности 91 микролитр реагента на трансфекцию.
Вихрь регента в течение трех-пяти секунд и пипетка 90 микролитров трансфектного раствора в трубку, содержащую 10 микролитров разбавленной РНК. После нежного смешивания инкубировать раствор в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем добавить 100 микролитров трансфектного комплекса в одну колодец клеток. После четырех часов при 37 градусах по Цельсию замените среду тремя миллилитровами полной среды, содержащими соответствующий фактор роста.
На шестой день культуры замените культурные супернатанты из культур М1 тремя миллилитровами среды, дополненными сывороткой крупного рогатого скота плода, антибиотиками, липополисахаридом и интерфероном гамма и замените супернатанты из культур М2 средой, дополненной сывороткой из крупного рогатого скота плода, антибиотиками, M-CSF и интерлейкином-4. После 24 часов культуры, мыть каждую тарелку активированных макрофагов два раза со свежим PBS за стирку. Для анализа РНК и белка, подлизать прилагаемые клетки непосредственно в пластинах, чтобы сбор выпущенного содержимого клеток для их анализа.
Для цитометрического анализа потока, отсоедините клетки с двумя миллимолярной ЭДТА в PBS в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию, прежде чем аккуратно соскоб клетки от дна пластины, чтобы их сбор в 1,5 миллилитров микроцентрифуг труб для их анализа. Здесь показаны репрезентативные гистограммы M1-активированного контроля и клеток, полученных пациентом, с повышенным уровнем CD80 и CD83 и M2-активированных клеток с повышенным уровнем CD163 и CD209 по сравнению с неактивными Т0-клетками. Интересно, что CD80 и CD83, как представляется, более высоко выражены в клетках, полученных из-под контроля, по сравнению с клетками, полученными из ВИЧ.
Трансфекция свежесобранных моноцитов с скремблированной почти инфракрасной помеченной микроРНК приводит к более чем 90%-ной эффективности трансфекции, определяемой цитометрией потока и конфокарной микроскопией. Кроме того, трансфекция не значительно снижает жизнеспособность клеток, полученных пациентом, или контрольных клеток, независимо от стадии созревания клеток или условий трансфекции. Трансфекция приводит к эффективному downregulation целевого гена при трансфекции с конкретными малых вмешательства РНК в один день и день четыре после изоляции.
Кроме того, клетки, трансфицированные микроРНК-мимикой, демонстрируют 48-72-кратное увеличение экспрессии микроРНК по нетрансфицированным клеткам, в то время как все элементы управления трансфектом не показывают заметных изменений. Количество потроха клеток имеет решающее значение для выживания. Рекомендуем один миллион клеток на 35-миллиметровую тарелку.
Покрытие в среде, свободной от сыворотки, также значительно улучшит клеточное вложение. Клетки, полученные с помощью этого метода можно лечить с цитокинами или факторами роста для изучения дифференциальной реакции у пациентов, представляющих интерес и здорового контроля.
