Изучение транспортировки бактерий в пористых системах имеет важное значение в отношении загрязнения, распространения болезней и биовосстановления. Для этих экспериментов в математических моделях, работающих на одной клетке, требуется популяция и уровень микробного сообщества. Здесь мы представляем инструменты для изучения бактериального транспорта с использованием микрофлюидных устройств и микроскопии, а также более крупные устройства в сочетании с цитометрией потока.
Сочетание микрофлюидных устройств с микроскопией и цитометрией потока предлагает ряд возможностей для изучения бактериальных транспортных явлений в различных пространственных масштабах. Для полного изучения этого протокола предлагается иметь предыдущий опыт в области микроскопии, базовой обработки изображений, проектирования микрофлюидных устройств и освоения цитометрии потока. В этом видео описаны два метода изучения бактериального транспорта в различных пространственных масштабах.
Первый метод, основанный на микрофлюидных устройствах, опирается на микроскопию для подсчета отдельных клеток. Эта система может быть использована для изучения бактериального транспорта в нескольких пространственных масштабах от пор до всей пористой системной шкалы. Второй метод, использующий более крупные жидкостные устройства в сочетании с автоматизированной цитометрией и цитометрией потока, может быть использован для изучения бактериального транспортного явления в масштабе целых пористых систем.
Такие методы могут также использоваться в лабораторных исследованиях, а также в небольших полевых исследованиях. Для начала спроектировать нужную пористую геометрию, которая состоит из матрицы кругов. На основе выбранной геометрии подготовь форму с использованием стандартной фотолитографии СУ-8.
Подготовка 50 граммов PDMS, добавив 90% еластомера до 10% от лечения агента до 90% еластомер по весу в чистом одноразовом контейнере и смешать два реагента с чистым инструментом. Нанесите вакуум 100 миллибар в течение 30 минут, чтобы удалить растворенный воздух и пузырьки. Поместите форму в чашку Петри и вылейте PDMS на форму на нужную высоту от двух до пяти миллиметров.
Накройте чашку Петри крышкой и держите ее на уровне 60 градусов по Цельсию в течение по крайней мере четырех часов. После этого дайте микрофлюидное устройство остыть до комнатной температуры. После охлаждения осторожно удалите желаемую порцию PDMS скальпелем.
Временно запечатать дно канала PDMS лентой. С перфоратором диаметром 0,5 миллиметра прокалывайте каналы для создания входов и розетки. Удалите ленту с канала PDMS и поместите канал с пористой стороной вверх.
Лечить стеклянный слайд и PDMS поверхностей с плазмой около 45 секунд каждый при комнатной температуре. Поместите предварительно обработаемый канал PDMS на предварительно обработаемую стеклянную горку и нагрейте при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 30 минут на горячей пластине, затем удалите микрофлюидное устройство из горячей пластины и охладьте его до комнатной температуры. Нанесите вакуум на 30 минут, чтобы удалить воздух из PDMS.
Для производства основы, содержащей поры отсека, использовать высокоточные микро фрезерования, чтобы удалить 0,5 миллиметра от базового слоя PMMA и мельницы паз размером 1,1 на 1,1 миллиметра для резиновой O-кольцо. Просверлите два резьбовых отверстия для входного и выходного в верхнюю часть жидкого устройства и 12 отверстий для винтов. Это служит крышкой жидкостного устройства.
После очистки жидкостного устройства, винт базы и крышки вместе с помощью 12 резьбовых отверстий. Удалите микрофлюид из вакуума и поместите его на стадии микроскопа. Используйте шприц-насос, чтобы насытить его разношерстным буфером.
Используя микроскопию Брайтфилда или фазовую контрастность, отрегулируйте увеличение, чтобы визуализировать отдельные бактериальные клетки и сосредоточьтесь на центре канала наблюдения. Переключите настройки пути света на микроскопию флуоресценции. Отрегулируйте фокус через смещение и время экспозиции камеры, чтобы решить отдельные бактериальные клетки.
В этом случае 100 миллисекунд. Затем вставьте входную трубку в двухмилитровую трубку, содержащую бактериальную суспензию. Переверните направление насоса и начните снимать подвеску со скоростью потока одного микролицера в минуту.
Сканирование поперечного сечения всего канала наблюдения, запись изображения каждую минуту. Импорт изображений на нужную программную платформу. Зафиксуй фон как среднее значение первых изображений, когда частицы не были записаны.
Вычесть фон из каждого изображения, чтобы удалить шум камеры и оптической аберрации. Обрезать изображения в регионе, представляющих интерес. Определите пороговое значение, равное интенсивности пикселей флуоресценции клеток, так что значения, большие, чем порог включают бактериальные клетки.
Используйте обработку изображений, чтобы вычесть пороговое значение из каждой картинки. Binarize в результате изображения так, что бактериальные клетки принимают значение одного, в то время как фон занимает значение нуля. Удалите кластеры пикселей с площадью меньше, чем самый маленький размер бактериальных клеток в пикселях.
Сумма binarized изображение, чтобы получить общее количество пикселей остальных кластеров. Разделите количество пикселей на средний размер бактериальной клетки на пиксели, чтобы получить оценку количества клеток. Превратите количество в концентрацию частиц на миллилитр.
Чтобы определить концентрацию инъекционной бактериальной суспензии, ввисьте бактериальную суспензию в канал наблюдения чистого микрофлюидного устройства со шприцем. Завехать изображение и рассчитать висячей бактериальной концентрации, как показано ранее. Визуализация прорыв кривых путем нормализации сточных вод бактериальной концентрации C с influent бактериальной концентрации C0 и построения C более C0 по сравнению со временем.
Для анализа локальных скоростей и траекторий бактерий, транспортируемых через пористую матрицу, переместите стадию микроскопа в область интереса и отрегулируйте фокус к центру микрофлюидного устройства. Установите оптическую конфигурацию для фазового контраста или микроскопии флуоресценции. Рекордные изображения замедленного действия и время экспозиции достаточно короткое, чтобы захватить бактериальное смещение.
В этом случае 50 миллисекунд. Запись фотографий в течение достаточного количества времени, например, три минуты. Чтобы удалить шум с каждого изображения, вычесть фон, который является средним от суммы всех записанных изображений.
Определите модуль численного градиента и нормализуете его по максимальному значению. Найти и записать бактериальные координаты и время получения изображения в файл с тремя столбцами. Выполните анализ отслеживания частиц для обработки записанных данных и вычисления траекторий.
Для получения профилей осаждения замыкаем композитное изображение всего пористого канала раньше, то есть фоном, и после инъекции бактериальной суспензии через микрофлюидное устройство. Удалите фон из изображений, записанных после бактериальной инъекции. Вычислить профиль осаждения D как сумму бактериального сигнала флуоресценции по поперечным участкам длины x пористого канала.
Визуализууй профиль осаждения в качестве локального сигнала флуоресценции по сравнению с длиной пористого канала. Чтобы настроить автоматизированный дозатор, поместите роботизированный дозатор рядом с жидкостным устройством. Подключите роботизированный дозатор к компьютеру под управлением BCNC и определите правильный порт com.
В BCNC нажмите кнопку «Домой», чтобы вернуть роботизированный дозатор в домашнее положение. Соедините перистальтический насос с водой, используя 50 сантиметров в длину, один миллиметр внутреннего диаметра труб, и отток с автоматизированным дозатором с помощью той же трубки. Насос культивирования среды через жидкое устройство.
Обратите внимание на прибытие среды в розетке трубки крепится к роботизированной дозатор и место 96-хорошо пластины, которая будет собирать оттока. В то же время активируйте роботизированный дозатор и вводите бактериальную суспензию через жидкое устройство PMMA со скоростью потока 0,2 миллилитров в минуту. Инъекционная бактериальная суспензия, эквивалентная нескольким объемам пор.
Например, в 30 раз больше объема жидкостного устройства. После инъекции переключитесь на стерильную среду культивирования до конца эксперимента. После того, как 96-хорошо пластины завершена, покрыть пластину и хранить при четырех градусах по Цельсию до потока цитометрии анализа.
Анализируйте образцы с цитометрией потока и визуализируете прорывные кривые, нормализуя бактериальную концентрацию стоков C с висячей бактериальной концентрацией C0 и планируя C более C0 по сравнению со временем. В этом исследовании, используя как подвижные, так и немольные Pseudomonas putida KT2440, последовательные эксперименты проводились в микрофлюидных устройствах PDMS со случайным набором столбов. Здесь показаны прорывные кривые, нормализуемые к концентрации инъекционных клеток, а также бактериальные траектории в шкале пор.
Были также проведены эксперименты с крупномасштабными жидкостными устройствами, измельченными из PMMA. В регулярно размеченную пористую матрицу вводили motile и non-motile Pseudomonas putida KT2440. Поразительно, но в пористой среде, лишенной биопленки, пестрый и не подвижной Pseudomonas putida KT2440 показал заметно иное транспортное поведение, основанное на прорывных кривых.
В пористой матрице, колонизированной в течение 48 часов со сложным сообществом биопленки потока, эти различия в кривых прорыва между подвижными и немостойными Pseudomonas putida KT2440 исчезли. Мы используем эту систему для изучения бактериального транспорта в потоках, но эти инструменты могут быть легко скорректированы для изучения бактериальных транспортных явлений в других инженерных и экологических систем. Бактериальный транспорт через гидратированные пористые средства массовой информации инкапсулируют процессы в нескольких пространственных масштабах.
Представленная здесь методология позволяет связать локальное перемещение бактерий в поровой шкале с микроскопическим транспортом на всей пористой среде.
