Увеличение доказательств свидетельствует о влиянии эстрогена сигнализации на толстой части физиологии, иммуногистохимия является перспективным методом для выявления рецепторов эстрогена в толстой кишке, и они развиваются в колит. Представляем полный и проверенный протокол иммуногистохимической визуализации рецепторов эстрогена в толстой кишке с использованием иммунофлуоресценции. Вместе с доктором Сильвией Михловской из Лаборатории микроскопической визуализации Лодзского университета мы продемонстрируем эту процедуру.
Поместите толстую кишку в чашку Петри. Разрежьте толстую кишку на один-два сантиметра фрагментами. Поместите каждый фрагмент на губку в надлежащим образом помечены гистологической кассеты.
Поместите кассету, содержащую фрагмент толстой кишки в 4%paraformaldehyde. Инкубировать в течение по крайней мере 24 часов при четырех градусах по Цельсию. Подготовка и программа процессора тканей в течение одного часа инкубации в 50%70%90%95%и 100% этанола, ксилена 100% этанола, и только ксилена, а также, по крайней мере три часа инкубации в жидком парафине.
Перенесите фрагмент толстой кишки в гистологическую коробку. Поместите коробку в заранее запрограммированный процессор тканей и запустите процессор. После инкубации в тканевой комбайн удалить толстую кишку из гистологической коробки и поместить фрагмент толстой кишки в металлическую форму, так что два конца толстой кишки находятся в вертикальном положении.
Заполните одну треть формы жидким парафином. Поместите плесень в области охлаждения при минус пяти градусах по Цельсию в течение нескольких секунд, а затем переместить плесень в область потепления при температуре 70 градусов по Цельсию. Затем поместите плесень в нижнюю часть гистологического ящика и накройте весь фрагмент толстой кишки жидким парафином.
Поместите металлическую форму, содержащую фрагмент толстой кишки и парафин в области охлаждения в течение нескольких минут. Затем удалить металлическую форму из толстой кишки и парафин блока. Инкубировать толстой кишки и парафин блока, по крайней мере 24 часов при четырех градусах по Цельсию.
После инкубации удалите излишки парафина из блока. Вставьте блок толстой кишки и парафина в полностью автоматизированный роторный микротом. Разрежьте фрагмент толстой кишки на пять микрометровых секций.
Перенесите одну секцию толстой кишки на водяную баню, разогретую до 40 градусов по Цельсию. Используйте помеченную стеклянную горку, чтобы удалить секцию толстой кишки из водяной ванны и инкубировать стеклянную горку при комнатной температуре в течение 24 часов. Во-первых, удалить парафин, инкубируя стеклянную горку в ксилена в течение пяти минут.
Повторите этот шаг три раза. Затем поместите стеклянную горку в смесь ксилена и 100% этанола в течение пяти минут. Повторите этот шаг три раза.
Используйте ряд снижения концентрации этанола для регидратации толстой кишки разделе. Погрузите слайд в этанол в течение пяти минут. Повторите три раза в каждой концентрации, прежде чем приступить к следующей концентрации.
Промыть стеклянную горку под проточной водой в течение пяти минут. Разогреть буфер поиска антигена до 95 до 98 градусов по Цельсию. Затем нагрейте стеклянную горку в кипящем растворе поиска антигена в течение 10 минут.
Чтобы предотвратить отходы реагентов, используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круг вокруг толстой кишки разделе. Затем инкубировать слайд в течение 10 минут в 3%-м растворе пероксиды водорода и воды. Вымойте слайд в стиральном растворе в течение пяти минут.
Затем инкубировать слайд в блокирующий раствор в течение одного часа при комнатной температуре. Удалите блокирующий раствор и добавьте от 20 до 50 микролитров первичных антител против E-R альфа, E-R бета, или G-P-E-R разбавленной. Инкубировать первичное антитело на ночь при четырех градусах по Цельсию в темноте.
Удалите раствор антитела. Вымойте слайд три раза в стиральный раствор в течение пяти минут каждый раз. Далее добавьте разбавленные вторичные антитела.
Инкубировать слайд со вторичными антителами, спрягаемыми красителем в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Удалите вторичный раствор антитела со слайда. Вымойте слайд три раза в стиральный раствор в течение пяти минут каждый раз.
Добавить разбавленный фторхром для визуализации мембраны и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Удалите раствор и мыть слайд три раза в стиральный раствор в течение пяти минут каждый раз. Добавьте несколько капель жидкости на основе глицерола DAPI, фторхрома для визуализации ядер клеток, непосредственно на участке толстой кишки.
Обложка его тщательно с крышкой слайда. Инкубировать толстой кишки раздел, по крайней мере 24 часов при четырех градусах по Цельсию. Проанализируйте секцию толстой кишки под конфокальные микроскопы с 20-х или 63-х целями и погружением в нефть.
Специфика антител, используемых в исследовании, была проверена с помощью клеток MCF-7. Антитела рецепторов эстрогена позволили обнаружение ядерных рецепторов эстрогена E-R альфа и E-R бета, а также мембраны связаны рецептор эстрогена G-P-E-R. Был также проведен отрицательный контроль, при котором клетки MCF-7 окрашивались только вторичными антителами, спряженными фторхромом и жидкостью на основе глицерола с DAPI.
Сильный цитоплазмический сигнал E-R альфа был найден в толстой кишке разделов, полученных от контрольных мышей и от мышей с TNBS-индуцированной болезни Крона. Однако, только двоеточия, полученные от контрольных мышей, имели E-R альфа-локализованную в цитоплазме клеток кубков. Конфокаленовая микроскопия также выявила цитоплазмическую локализацию бета-версии E-R в секциях толстой кишки как контроля, так и мышей, обработанных TNBS.
Аналогичным образом, цитоплазмическая локализация G-P-E-R была задокументирована в секциях толстой кишки, полученных от контрольных мышей и мышей, обработанных TNBS. Правильное позиционирование толстой кишки в форме имеет важное значение для создания правильного сечения. Фторхром следует подбирать по собственному спектру возбуждения и выбросов.
Этот метод также может быть применен к другим белкам, которые могут быть вовлечены в развитие колита. Обнаружение иммуногистохимии путем иммунофторесценции может быть распространено на окрашивание других белков в статусе направления белка-белка.
