Этот протокол для локализации иммунофлюоресценции in vivo, или IVIL, оценивает биораспределяние диагностических и терапевтических антител или антител на основе агентов для исследования, обнаружения и лечения рака. В отличие от обычного иммунофлюоресцентного окрашивания, при котором клеточная экспрессия антигенов раскрывается ex vivo, метод IVIL разъясняет, как антитела и антитела на основе агентов распределяются в живом животном. Это видео поможет понять общий рабочий процесс метода IVIL.
Он показывает важные детали для успешного воспроизведения протокола для других применений и антител. Наблюдайте мышей от пожеланную модель рака для сооместительного роста тумора через palpation или измерение caliper перед продолжать. Очистить кролика против мыши B7-H3 и кролика IgG изотипа контроля антител на опресняющие колонки для удаления консервантов и буферов хранения в соответствии с инструкциями производителя.
Aliquot дозировки 33 микрограммов каждого антитела конъюгировать в отдельных микроцентрифуг труб. После анестезии, как описано в текстовом протоколе, подготовьтесь к прививке хвостовых вен антител. Дезинфицировать хвост животного, вытирая три раза спиртовой салфеткой.
Расширяют вены хвоста, нагревая тепловой прокладкой в течение примерно 30 секунд. Избегайте нагревания всего животного. Используя катетер хвостовой вены 27-го калибра, вставьте иглу бабочки в одну из двух вен бокового хвоста.
Визуализуть приток крови обратно в катетер, чтобы убедиться, что игла правильно размещены так, что решения будут полностью войти в животное по сравнению с захватили в хвосте. Используйте кусок хирургической ленты, чтобы тщательно исправить хвост с вставленной иглой на сцену. Промыть катетер 25 микролитров стерильного фосфатно-буферного солевого раствора.
Затем ввимите раствор антител в катетер с помощью инсулиновых шприцев. Промыть катетер еще раз с 25 микролитров стерильных PBS. Снимите иглу с хвоста и нанесите давление, чтобы остановить кровотечение.
Выполните гуманную эвтаназию мыши, как описано в текстовом протоколе, и положите мышь в положение лежа. Используйте хирургические ножницы и типсы для акцизных опухолевых тканей. Используйте типсы, чтобы схватить только внешний слой кожи между набором молочных желез ближе всего к хвосту, и сделать небольшой разрез с парой хирургических ножниц.
Ввести закрытые ножницы в разрез, и медленно открыть кончик, чтобы тщательно отделить кожу от основной мембраны брюшной стенки, сохраняя его нетронутыми. Сделайте вертикальный разрез вверх по животу, продолжая отделять кожу от внутренней мембраны. Между третьим и четвертым молочных желез, сделать горизонтальный разрез по всему животу, чтобы опровержение кожи и визуализации молочных желез.
Хватая каждую опухоль или нормальную железу типсами, тщательно обрезайте прикрепленную кожу хирургическими ножницами. Поместите вырезанные ткани в ткани одноразовые базовые формы, которые предварительно помечены и заполнены оптимальной температурой резки встраивания среды. Быстро заморозить формы путем размещения на сухом льду.
Для изучения внецелевых поставок, акцизных других тканей или органов, представляющих интерес. Используя криостат, раздел замороженных блоков ткани на 10-микрон толщиной, и место смежных разделов на предварительно помеченные адгезии стеклянные слайды. Промыть замороженные ткани слайды с комнатной температурой PBS в течение пяти минут, чтобы удалить встраивание среды.
Демаркировать секции тканей гидрофобной заградительной ручкой, чтобы уменьшить объем растворов, необходимых во время окрашивания. Зафиксировать секции тканей с 4%paraformaldehyde раствор в течение пяти минут. После полоскания слайдов в PBS в течение пяти минут, пронизывают секции тканей с 0,5%Triton X-100 в PBS в течение 15 минут.
Промыть слайды снова в PBS в течение пяти минут. Блок тканей с PBS, содержащих 3%weight на объем крупного рогатого скота сыворотки альбумин и 5%volume на объем козьей сыворотки в течение одного часа при комнатной температуре. После полоскания слайдов в PBS в течение пяти минут, инкубировать разделы с учета первичных антител, таких как общий ядерный, сосудистый или цитоплазмический маркер.
Здесь крыса анти-мышь CD31 используется на один-к-100 разбавления в блокирующий раствор. Слайды с первичными антителами остаются на ночь при четырех градусах Цельсия, защищенных от обезвоживания на подносе для слайдов. После инкубации, промыть слайды в PBS в течение пяти минут три раза.
Изменение PBS каждый раз. Инкубировать слайды со вторичными антителами для обозначения основных антител. Для этого приложения, визуализировать анти-B7-H3 антитела с помощью Alexa Fluor 546 конъюгированных коз анти-кролик антитела, и визуализировать CD31 с Alexa Fluor 488 коза анти-крысы вторичного антитела в блокирующий раствор.
Защитите горки от света и обезвоживания на подносе для слайдов в течение одного часа при комнатной температуре. После полоскания слайдов в PBS, как и прежде, применить одну каплю монтажной среды в центр ткани ломтик. Аккуратно поместите крышку, избегая захвата пузырьков воздуха.
Печать края крышки с четким лаком для ногтей, и дайте высохнуть. Продолжить конфокалиптического микроскопического изображения и количественного анализа изображений, как описано в текстовом протоколе. Представительные конфокальные микрографы показывают сравнение специфических антител B7-H3-ICG конъюгированных и неспецифических изотипных антител-ICG конъюгированных локализаций в муриновых молочных железах, содержащих нормальные или карциномные ткани.
Нормальные молочные железы мурина от животного внутривенно вводили с Iso-ICG или B7-H3-ICG и противопоявленные CD31 не показывают окрашивания конъюгированных антител. Нормальные ткани, как было показано, не имеют выражения B7-H3 стандартным ex vivo иммунофторесценции окрашивания. При инвазивных опухолях молочной железы, B7-H3-ICG сильно связывается с сосудами, первой точкой контакта in vivo, а затем способен экстравазать из сосуда в неоднородно испачкать эпителий опухоли.
Iso-ICG показывает неспецифическое накопление в опухолевых тканях. Стандартное иммунофлуоресцентное окрашивание ex vivo показывает равномерное выражение маркера B7-H3 на эпителиальных и эндотелиальных клетках. Репрезентативные конфокальные микрографы показывают метод локализации иммунофлюоресценции in vivo для обнаружения экспрессии netrin-1 или экспрессии контроля изотипа в муриновой карциноме и нормальных молочных железах.
Виво иммунофлюоресценции локализации подтверждает эпителиальный сигнал для нетрина-1 в опухолях MMTV-PyMT, но не в нормальных молочных желез. Кроме того, существует сильный сигнал нетрина-1 на эндотелиальных клетках опухолей молочной железы, о чем свидетельствует колокализованный желтый сигнал. Сигнал значительно слабее в нормальных молочных желез.
Метод IVIL необходимо оптимизировать с точки зрения дозировки антител, сроков сбора тканей и вторичного разбавления антител для успешной реализации. IVIL позволяет таргетирование конформных эпитопов, которые не могут быть обнаружены с помощью стандартного иммунофлуоресценции окрашивания, которое требует обработки тканей. Кроме того, здоровые органы опухолевых мышей могут быть собраны для оценки внецелевой доставки терапевтических антител.
С расширением использования антител на основе терапии и контрастных агентов в исследованиях рака и управления, метод IVIL является весьма применимым к фармацевтическим исследованиям и разработкам. Исследователи в области лечения рака, молекулярной визуализации, воспаления и других областях могут обнаружить, что метод IVIL предоставляет полезную информацию.
