Мы опишем метод литографии на основе трафаретной литографии, свободный от одноклеточных микропаттернов, который преодолевает множество препятствий, связанных с фотолитографией и мягкой литографией. Трафареты многоразовые и процесс недорогой и настраиваемый. Этот метод открыл новый путь для неинженерных исследователей для изучения формы клеток и области индуцированной механотрансдукции в различных физиологических и патологических контекстах.
Кроме того, этот протокол позволяет для микропаттернирования тысяч клеток, которые могут быть использованы для высокой пропускной способности скрининга наркотиков и моделирования заболеваний в блюде. Визуальная демонстрация облегчит имплантацию двух важнейших шагов: отсоединения крышки от гидрогеля, достаточной сушки гидрогеля перед размещением трафарета. Приготовьте раствор гидрогеля полиакриламина в новой 50-миллилитровой пропиленой центрифуге, как описано в рукописи.
Далее, чтобы подготовить 5%фотоинициатор раствор, растворить ингредиенты в 700 микролитров 100% этанола. Ингредиенты не растворимы в воде, поэтому не забудьте полностью раствориться вихрем. Добавьте 300 микролитров PBS для конечного объема одного миллилитра.
Работая на льду, разбавляют подвальные мембраны матричным белковым раствором с ледяным холодным DMEM F12 media или 1X PBS к оптимизированному соотношению разбавления. Держите на льду для более длительного использования. При работе с мембранной матрицей подвала, убедитесь, что всегда работать на льду и использовать ледяные растворы в охлажденных пипеток советы и трубки.
Поместите УФ-скамейке лампы в биологической безопасности капот. Далее поместите стерилизованные парафиновые пленки, подготовленные ранее. Если парафиновые пленки не полностью сухие, используйте вакуумную систему аспирации для удаления любой остаточной жидкости.
Используя автоматические типсы, поместите шесть автоматических крышки на парафиновую пленку по шесть в каждой чашке Петри. Для подготовки УФ-перекрестного связуемого полиакриламинида окончательное решение, разбавить раствор фотоинициатора с раствором гидрогеля полиакриламинида. Стерилизовать раствор с помощью 50-миллилитрового фильтра с размером поры 0,22 микрометра.
Затем выпейте 200 микролитров УФ-перекрестного полиакриламинида окончательного раствора на каждый из шести стеклянных крышки в чашках Петри. Используя автоматические типсы, тщательно накройте каждую крышку вторым крышкой, улавлив слой раствора между двумя крышками. Поместите чашки Петри, содержащие крышки, под лампу УФ-скамейки с незамечтой крышкой.
Покрытие белой бумаги на небелой поверхности важно, чтобы свести к минимуму потерю УФ-интенсивности. Для защиты от УФ-излучения накройте лампу алюминиевой фольгой. Фотополимеризировать полиакриламид гидрогели в течение пяти минут.
Используйте лезвие бритвы, чтобы тщательно отделить каждую пару coverslips. Заполните резервуар, содержащий шесть гидрогелевых композитов с помощью PBS. После полоскания в течение пяти минут, вернуть гидрогель coverslip композитов парафина пленки в чашке Петри.
Получить трубку Сульфо-САНПА от хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добавьте 1 200 микролитров предварительно охлажденного PBS в трубку и перемешайте с помощью трубчатых вверх и вниз. Выдавайте 200 микролитров разбавленного Сульфо-САНПА На парафиновую пленку в чашке Петри.
Поместите гидрогель охватывает композит над Сульфо-САНПАХ с гидрогелем, контактным с Сульфо-САНПА. Далее поместите гидрогель coverslip композитов под УЛЬТРА лампы и подвергать их в течение пяти минут, чтобы активировать Сульфо-SANPAH. Если Sulfo-SANPAH превращается из оранжевого в коричневый, указывающий на успешную активацию и включение, переходите к следующим шагам в течение 10 минут.
Пополнить одноразовый полипропиленовый резервуар свежим PBS. Перенесите активированные гидрогелевые композиты в резервуар и прополощите их на короткое время, чтобы удалить несвехую Сульфо-САНПАХ. Поместите гидрогель coverslip композитов на парафиновой пленки в чашках Петри и тщательно мазок их стерильной ворсинки без салфеток.
Поместите трафарет поверх каждого гидрогеля coverslip композитных. Для обеспечения плотного уплотнения между трафаретом и композитом, удалить избыток влаги путем dabbing с автоклавом ворса без салфеток. Тщательно обойтись разбавленной мембраны мембраны белковый раствор размещения 200 микролитров на вершине каждого гидрогеля coverslip композитных.
Инкубировать конструкции на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день перенесите композиты на тарелку из шести колодец. Плотное уплотнение между гидрогелем и трафаретом может быть легко проверено, наблюдая, сохранился ли раствор матричного белка поверх трафарета.
Неспособность сформировать плотный уплотнитель приводит к быстрой утечке белкового раствора через отверстия. Полностью погрузите композиты в PBS. Используя автоклавный пинцет, тщательно отделяйте трафареты от гидрогелей, не разрывая гидрогели.
Удалите PBS из скважин и пополнить скважины с DMEM. Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию. После удаления пластины из инкубатора, изучить DMEM.
Если DMEM не облачно, гидрогель coverslip композиты готовы к использованию для покрытия клеток. Стенсилы были изготовлены, содержащий массивы квадратов и прямоугольников. Из трафаретов были получены микропаттерновые гидрогелевые субстраты и острова матричного белка.
Были также получены сотовые острова. Например, острова выведенных человеком плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами. Концентрация белка матрицы сыграла важную роль в создании надлежащих моделей.
Оптимальная концентрация привела к однородному распределению белков. Концентрации субоптимального матричного белкового раствора привели к неоптимальной картине. Очень важно использовать переднюю сторону трафарета.
При использовании задней стороны трафарета размер матричных белковых островов увеличивается за счет направления лазерной резки. При использовании задней стороны трафарета существенно не влияет на ширину прямоугольных узоров, высота значительно увеличилась, что привело к снижению предполагаемого соотношения сторон. Узор на основе стенцилей применялся к подстратам кремниевых еластомера.
Узорчатые кардиомиоциты на подложке кремния были визуализированы иммуноцитохимией сердечного тропонина Т при низком увеличении и саркомерным белком альфа-актинин при высоком увеличении. Трафарет на основе шаблона был также применен к шаблону два кардиомиоцитов бок о бок на гидрогели с различными жесткости. Открытие плюрипотентных стволовых клеток и соответствующих протоколов дифференциации человека сделало эту модель человека в пробирке идеальной для изучения онкогенеза и патогенеза.
Однако основным ограничением использования системы IPS является отсутствие структуры микроокнироники, которая имеет особый биохимический состав и жесткость взаимодействия с клетками. Узор можно комбинировать с микроскопией силы тяги и анализами иммуноцитохимии для характеристики структуры и функции кардиомиоцитов. Анализ типов клеток, полученных IPS, в нашем случае кардиомиоцитов, в более физиологической морфологии открывает возможности для изучения сложных кардиомиоцитов в культуре блюдо.
Этот метод также может быть применен ко многим другим системам, таким как и высокое содержание скрининговых пластин. Форма и субстрат могут быть легко приспособлены к приложению.
