Этот метод может иметь ответы на ключевые вопросы в области островков поджелудочной железы о дифференциации линии островков поджелудочной железы, созревания и регенерации. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет сбор одноклеточных островков поджелудочной железы для генерации высококачественных одноклеточных РНК-секвенирования данных. Применение этой техники распространяется на терапию диабета и других эндокринных заболеваний поджелудочной железы через транскриптомный анализ эндокринных одиночных клеток поджелудочной железы на патологических условиях.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как вставка иглы в узкий желчный проток поджелудочной железы для перфузии может быть сложно. Для эмбрионального дня 17,5 эмбрионов. После открытия брюшной полости используйте пинцет локтя для переноса висцеральной ткани на шестиметровую черную нижнюю тарелку, содержащую холодный PBS.
Используйте типсы, чтобы отделить поджелудочную железу от висцеральной ткани. И поместите ткани поджелудочной железы в 20 миллилитров флакон, содержащий пять миллилитров холодного раствора коллагеназы. Для послеродового дня от нуля до 15 мышей, тщательно вскрыть все доли поджелудочной железы перед размещением ткани в коллагеназы.
Для послеродового дня от 18 до 60 мышей, сначала удалить xiphoid и извлечь кишечника в правую сторону брюшной полости. Нажмите левую и правую медиальные доли печени с каждой стороны, чтобы разоблачить желчный пузырь и общий желчный проток. И зажим дуодена с парой небольших зажимов судна в верхней и нижней позиции на фланге сайт, где желчный проток входит в двенадцатиперстную часть.
Затем загрузите 5 миллилитровый шприц, оснащенный 30-ми калибровочных иглами с холодным раствором коллагеназы. И использовать микроскоп, чтобы вставить кончик иглы в желчный пузырь. Тщательно и плавно манипулировать иглой через общий желчный проток.
И угнетать поршень, чтобы пронизать поджелудочной железы с одного до пяти миллилитров раствора коллагеназы в зависимости от размера мыши. Когда все растворы были пролиты, используйте типсы, чтобы немедленно перенести поджелудочную железу в 20 миллилитров флакон, содержащий пять миллилитров свежего холодного раствора коллагеназы. Когда все ткани поджелудочной железы были собраны, поместите флакон в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение трех минут, а затем три-пять минут нежной тряски.
Затем процедите переваренный продукт через 0,25-миллиметровый нейлоновый ситечко в новую 50-миллилитровую центрифугу. И использовать 20 миллилитров шприц, содержащий ледяной PBS тщательно мыть ситечко. Для послеродового дня от 18 до 60 pancreata, центрифуга фильтрованный образец и повторно использовать ткани в 30 миллилитров холодного PBS.
Затем декантировать ткань подвески в шесть сантиметров черной нижней блюдо, и использовать 200 микролитр пипетки и рассечения микроскопа, чтобы выбрать островки для передачи в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, содержащей небольшой объем холодного PBS. Для эмбрионального дня 17,5 после натального дня 15 pancreata, центрифуга фильтруемой ткани поджелудочной железы и повторно гранулы в трипсин-ЭДТА раствор для четырехминутной инкубации в 37 градусов по Цельсию водяной бане. В конце инкубации, осторожно попробуйте оценить гранулы в течение одной минуты с 200 микролитер пипетки, а затем добавление в 0,5 раза объем холодной сыворотки крупного рогатого скота плода с нежным вихрем, чтобы остановить пищеварение.
Затем соберите дайджест путем центрифугации и повторно усвоить клетки в 200 микролитров буфера FACS в 5 миллилитров FACS трубки для сортировки по цитометрии потока. Для сбора одной ячейки и лиза, aliquot свежеприготовленный буфер лиза ячейки в восемь трубок ПЦР полосы, и передать одну ячейку в каждой. Vortex образцы для лиза клетки для выпуска РНК, а затем центрифугации в течение 30 секунд при четырех градусах по Цельсию, и немедленное хранение на льду.
Для обратной транскрипции, инкубировать лисаты в течение трех минут при 72 градусов по Цельсию, а затем одну минуту на льду. Кратко центрифуга образцов в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия и добавить 5,7 микролитров обратной транскрипции смеси для каждого образца довести общий объем до 10 микролитров для каждого образца. После мягкого вихря и центрифугации загрузите образцы в термоциклер и запустите программу обратной транскрипции.
Для предварительной амплификации полимеразной цепной реакции, или ПЦР, добавьте 15 микролитров смеси ПЦР в каждый образец, содержащий первые реакции пряди, а затем нежный вихревой и центрифугации. Затем загрузите образцы в термоциклер и запустите программу ПЦР. Для очистки ПЦР добавьте в каждый образец 25 микролитров повторного очищения ДНК и хорошо перемешайте вихрем.
Затем быстро спина образцов при комнатной температуре, чтобы собрать жидкость, избегая при этом урегулирования бисера. После пяти минут при комнатной температуре поместите образцы на соответствующую магнитную подсюх, тщательно удаляя и отбрасывая супернатант, когда раствор чист. Вымойте бисер двумя 30 секундами моет в 200 микролитров свежеприготовленных 80% этанола на стирку.
И отбросить оставшийся этанол после второй стирки. Когда бисер высохнет воздух, добавьте 11 микролитров воды без нуклеазы, чтобы утоить цель ДНК из бисера, а затем вихри. Затем быстро центрифуга образцов, вернуть образцы на магнитный стенд, пока решение ясно и передачи 10 микролитров каждого образца в новую трубку ПЦР.
Успешно усиленная cDNA должна иметь полную длину выше 500 базовых пар и обогащаться от 1,5 до двух кило базовых пар. Кроме того, как правило, от 500 до 600 базовых пар обогащения кДНА наблюдается в инсулине один RFP плюс клетки, которые могут представлять инсулин стенограммы. Тем не менее, фрагменты cDNA около 100 базовых пар являются грунтовки димеры, которые, как правило, вызваны чрезмерным грунтовки и которые должны быть удалены путем повторения шага очистки ДНК.
Фрагменты cDNA между 100 и 500 базовыми парами обычно представляют собой деградированные кДНК, что вызвано плохим состоянием клеток или проблемами региона, такими как загрязнение RNase, и должно быть исключено. После очистки библиотек cDNA для секвенирования, cDNA в диапазоне от 250 до 450 базовых пар могут быть получены путем добавления бисера очистки ДНК к первому и второму раундам очистки. После очистки шарика ДНК оценка качества секвенирования должна быть больше 30 во время оценки качества секвенирования.
Для получения высококачественных клеток для анализа ниже по течению исключаются клетки с менее чем 0,5 миллиона картографических считываниями или менее чем 4 000 обнаруженных генов, что облегчает характеристику различных групп клеток и идентификацию генов, которые неоднородно выражены в различных группах после основного анализа компонентов и иерархической кластеризации. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы пролиться поджелудочной железы быстро до пищеварения коллагеназы, чтобы избежать островка над пищеварением и поддерживать RNase свободной окружающей среды во время одноклеточных процедур. После этой процедуры, другие методы, такие как островок изображения и культуры могут быть выполнены для облегчения визуализации структуры островка и для изучения клеточных реакций и стимуляции наркотиков.
После развития, этот метод проложил путь для исследователей в области исследований поджелудочной железы, чтобы исследовать механизмы развития и регенерации линии островков, а также прогрессирования диабета у млекопитающих.
