Реакция теплового шока является важным клеточным стрессом ответ путь, который поддерживает цитоплазмический протеостаз и может быть охарактеризована на молекулярном, клеточном и организме уровнях в морских элеганов. Мы представляем ряд стандартизированных протоколов и передовой практики, которые генерируют надежную индукцию реакции теплового удара в морских элеганах, чтобы помочь повысить воспроизводимость в области реагирования на тепловой удар. Мы показываем, что термотерпимость, широко используемый анализ организма не зависит от реакции теплового шока.
Вместо этого мы рекомендуем использовать тепловое восстановление, анализ организма, который зависит от реакции теплового удара. Реакция теплового удара затухается с началом откладки яиц. Таким образом, сроки развития является критической переменной, которая должна быть учтена в экспериментах теплового удара ответ.
Начните с создания синхронизированной популяции червей. Используйте платиновый провод выбрать для передачи примерно 10 gravid взрослых червей на свежую тарелку. Убедитесь в том, чтобы удалить любые яйца или личинки, которые, возможно, были переданы со взрослыми.
Разрешить червей откладывать яйца в течение одного часа, а затем удалить взрослых из тарелки. Поддерживайте синхронизированных червей при температуре 20 градусов по Цельсию до желаемой стадии развития, принимая во внимание, что сроки развития варьируется в зависимости от каждого штамма и температуры, при которой черви подняты. Когда черви будут готовы к тепловому удару, оберните пластины парафиновой пленкой и используйте стойку пробирки с свинцовой массой, чтобы погрузить их в циркулирующую водяную ванну при температуре 33 градуса по Цельсию в течение одного часа.
Восстановить пластины из водяной бани и высушить их бумажным полотенцем. Удалите парафиновую пленку и дайте червям восстановиться при 20 градусах по Цельсию в течение шести-24 часов, что будет достаточным временем для синтеза GFP. Чтобы подготовить слайды для визуализации, распоимите слайд микроскопа между двумя другими слайдами, на которых есть полоса лабораторной ленты.
Сделать 3%agarose раствор в воде и нагревать его в микроволновой печи, пока агарозы растворяются. Затем используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы разместить около 150 микролитров агарозы в центре горки. Немедленно накройте слайд пустым слайдом, поместив его перпендикулярно так, чтобы он лежит на лабораторной ленте, затем аккуратно удалите его.
Чтобы обездвижить червей, добавьте небольшую каплю одного миллимолярского левамизола, буфера M9, в центр агарозной площадки и перенесите 10 червей в каплю с помощью платинового проволоки. По желанию, распространение левамизола с внешней стороны агарозы площадку и выровнять червей с забрать, когда они становятся парализованными. Обложка червей с крышкой скольжения и изображение их как можно скорее с помощью флуоресценции микроскопа.
Для выполнения анализа термовосстановлений, синхронизировать червей и поддерживать их на 20 градусов по Цельсию до желаемой стадии развития. Затем тепло ударять их в течение шести часов. Снимите пластины с водяной ванны и дайте им восстановиться при 20 градусах по Цельсию в течение 48 часов.
После выздоровления подсчитайте количество червей, которые могут сразу же уходить после механической стимуляции без отрывистых движений или паралича. Для визуализации индукции реакции теплового удара на клеточном уровне были проанализированы два флуоресцентных штамма морских элеганов. В отрицательных контрольных образцах без теплового удара репортер hsp-16.2 показал нормальную автофлуоресценцию, но у репортера hsp-70 была составная флуоресценция в анальной депрессольной мышце.
После одного часа теплового удара, надежная флуоресценция наблюдалась в обоих репортеров, когда РНК был использован, чтобы сбить hsf-1 до измерения индукции репортера. Флуоресценция обоих штаммов была серьезно снижена, что свидетельствует о том, что эти репортеры являются hsf-1 зависимыми. Для количественной индукции реакции теплового шока на молекулярном уровне, два местных белка теплового шока были измерены с RT ключевых ПЦР.
Было установлено, что один час 33 градусов по Цельсию тепловой шок приводит к более чем 2000 раз увеличение относительной экспрессии двух генов теплового шока. Анализ термооткрытия показал, что воздействие шестичасового теплового удара привело к 20%-му снижению числа червей с нормальным движением после 48-часового восстановления. Нокдаун hsf-1 вызвало резкое снижение нормального движения, с более чем 95% червей, показывающих отрывистые движения или паралич после того, как prodded.
В отличие от этого, нокдаун hsf-1 не оказал существенного влияния на результаты анализа термотерпимости, в котором черви подвергаются воздействию непрерывной температуры 35 градусов по Цельсию и процент червей жив измеряется в различных точках времени. При выполнении этой техники в первый раз, убедитесь, что обернуть пластины с парафиновой пленкой в два раза, чтобы предотвратить воду от входа в пластины и губит эксперимент. Молекулярные анализы могут быть расширены в геномных анализах с использованием РНК-сек.
Другие анализы организма, пострадавших от теплового шока ответ может быть включен, таких как продолжительность жизни. Уникальная способность соотносить молекулярные, клеточные и организмальные анализы теплового шока в морских элеганах оказалась неоценимой для понимания роли этого пути в развитии и болезни.
