Эти методы могут быть использованы для характеристики стрессовых реакций в C.elegans и для определения того, генетические или фармакологические возмущения влияют на активацию защитных клеточных путей. Эти методы позволяют быстрое и высокой пропускной способности тестирования сотен возмущений, таких как ген нокдаун как на молекулярном и физиологическом уровнях. Чтобы убедиться, что анализ выполняется должным образом, включите положительный и отрицательный контроль.
Синхронизируйте здоровых, сытых животных до нужной стадии и используйте свежие пластины для эксперимента. Визуализация микроманипуляции червей с выбором может помочь новым пользователям понять, как черви могут быть выстроены и оценены на жизнеспособность. Демонстрацией процедур будут Фил Франкино, Холли Гилдеа и Мелисса Меткалф, аспиранты нашей лаборатории.
Для использования животных, выражаюющих GFP под промоутером белка теплового шока четыре для активации эндоплазмической стикулум развернулся ответ белка, расти синхронизированных животных репортер на 20 градусов по Цельсию до стадии L4 и мыть червей от пластины с помощью M9 среды и передачи в трубку. После сбора червей центрифугации, заменить M9 с 25 нанограммов на миллилитр препарата, представляющих интерес в M9 или диметилового сульфоксида в M9 в контроль животных труб. Затем поместите червей на вращающейся платформе в течение трех-четырех часов при 20 градусах по Цельсию.
В конце инкубации, центрифуга червей, чтобы поселиться перед заменой раствора лечения с 15 миллилитров M9 в одиночку. После двух моет, передать животных NGM пластин или NGM РНК вмешательства пластин по мере необходимости и позволяют червей восстановить ночь при 20 градусов по Цельсию. Когда черви выздоровели, добавьте от пяти до 10 микролитров 100 миллимолярный азид натрия на стандартную пластину NGM без бактерий и поместите тарелку червей под рассекающий микроскоп.
Перенесите от 10 до 20 животных из тарелки в пятно азаида натрия. Звери должны захватить движение вскоре после посадки в соляной раствор. После того, как азид натрия испарился, выстроить животных в желаемую установку изображений с передней и задней сторон в той же ориентации для всех животных и сразу же поместить пластину животных под стерео микроскопом.
Запустите программное обеспечение для визуализации стерео микроскопа и под вкладкой приобретения, нажмите открытые проекты и папку, чтобы открыть новый проект. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите переименование, чтобы переименовать папку. Распоистив образец червя под микроскопом цели и использовать Brightfield настройки, чтобы найти правильный координационный центр червей, чтобы свести к минимуму флуоресцентное отбеливание.
Центром образца будет точка, в которой линия яиц хорошо видна и нечеткая. Установите время экспозиции, чтобы убедиться, что пиксели не насыщены, а также убедиться, что сигнал выше предела обнаружения. После настройки времени экспозиции, увеличения, фокусировки и конденсаторов Брайтфилда до соответствующих настроек нажмите кнопку захвата изображения, чтобы получить изображение.
Для визуализации с помощью соединения широкое поле микроскопа, место базового контроля лечения пластины на соединение широкое поле микроскоп этапе и использовать сенсорную панель для запуска программы управления. Создайте новый альбом и имя файла и распоимить пластину под объективом цели. Используйте базовый контроль и положительные контрольные пластины, чтобы установить время экспозиции и интенсивность флуоресценции, чтобы сигнал был виден, но не насыщен.
Затем сохраните изображения Brightfield и GFP FITC. Для количественной оценки индукции репортера с помощью цитометрии потока крупных частиц сначала включите цитометрические лазеры и откройте программное обеспечение цитометра. Нажмите, чтобы включить лазеры в окне программного обеспечения и нажмите запустить, чтобы инициировать лазер в окне всплывающего окна аргон лазерного управления.
Когда лазер достигает около 12 милливатт и уровень источника света 488 поднимается примерно до 12, нажмите сделано и проверить четыре значения давления. Если значения похожи на значения, наблюдаемые в исходной настройке, проверьте поле OK давления. Далее, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха или мусора, блокирующего поток оболочки и образца через поток ячейки, нажмите чистый несколько раз.
Затем выключите сортировку и на оболочке, чтобы перезапустить поток. Чтобы проверить скорость потока, соберите оболочку в течение 60 секунд. Соберите оболочку в 15 миллилитровую трубку в течение 60 секунд.
Скорость потока должна быть от 9 до 10 миллилитров в минуту. Для запуска образцов отрегулируйте мощность лазерного фотомультиплера до уровня, достаточно высокого, чтобы сигнал был выше предела обнаружения, но не выше предела насыщения. Выполните размер gating, чтобы исключить пузырьки, мусор, яйца и другие нежелательные мелкие частицы и включить только животных, представляющих интерес, таких как взрослые.
Когда параметры скрининга были установлены, добавьте подготовленных червей в чашку и нажмите приобрести. Следите за тем, чтобы вся жидкость не была взята в машину, так как это приведет к тому, что цитометр потока будет приниматься в воздухе и создавать пузырьки внутри детектора. Когда образец низкий и / или достаточно животных были собраны, нажмите кнопку остановить.
Для хранения закрытых данных, основанных только на ограничениях размера, нажмите настройки, хранение данных, только закрытые, и хранить закрытые для сохранения данных. Затем промыть чашку сбора с деионизированной водой и удалить мыть вакуумом три раза, прежде чем повторить анализ со следующим образцом. Для измерения митохондриальной и окислительной чувствительности стресса, добавить от 50 до 75 микролитров Paraquat в M9 до 8 до 10 скважин на состояние плоского дна 96-хорошо пластины и передачи от восьми до 10 червей в состоянии каждой скважины Паракват.
Каждые два часа, нажмите пластину мягко, чтобы заставить живых животных трэш или согнуть, чтобы забил количество мертвых животных на колодец. Для измерения температурной чувствительности животных, инкубировать червей в течение трех-четырех дней при температуре 20 градусов по Цельсию, прежде чем покрытие от 10 до 15 животных на тарелку на состояние в общей сложности от четырех до шести пластин. Затем поместите пластины в 34 или 37 градусов по Цельсию инкубатор и оценка выживания червя каждые два часа, как только что продемонстрировали.
Репортер hsp-4 имеет минимальное базальное впечатление в отсутствие стресса, но демонстрирует надежное выражение GFP, когда животные подвергаются эндоплазмическому стрессу стикулума с помощью препарата Туникамицин. Эти различия также можно количественно оценить с помощью цитометра потока крупных частиц. Кроме того, индукция трансгена при эндоплазмическом стрессе стикулум может быть полностью супрессирована нокдауном XBP-1 с помощью РНК-интерференции.
Подобные анализы могут быть выполнены для измерения митохондриального стресса, окислительного стресса и теплового стресса. Целые физиологические реакции животных на стресс также могут быть измерены с помощью нескольких анализов выживания. Например, воздействие туникамицина используется для измерения чувствительности эндоплазмической ретикулумов к стрессу.
Нокдаун гена XBP-1 приводит к значительному повышению чувствительности к туникамицину. Кроме того, воздействие химического агента Паракват используется для измерения окислительной и митохондриальной чувствительности к стрессу. Нокдаун гена DAF-2 приводит к значительному повышению устойчивости к параквату.
Термотолерантность может быть измерена путем определения выживаемости животных при повышенных температурах и может быть построена как кривая выживания. Эти анализы должны быть выполнены по крайней мере четыре-шесть раз, и все репликации должны быть построены друг против друга, как термотолеранс демонстрирует невероятно высокую изменчивость по сравнению с другими анализами стресса. При визуализации животных крайне важно установить параметры таким образом, чтобы не было перенасыщения сигнала или под ним, и обеспечить, чтобы на протяжении всего эксперимента использовались одинаковые параметры.
Протоколы визуализации, описанные здесь, подотменны для крупномасштабного скрининга, включая экраны в ширину генома, и отлично подошел как для исследовательских, так и для подтверждающих исследований, за которыми можно следить с помощью описанных физиологических анализов.
