ECLIA является простым, но эффективным методом количественной оценки клеточных уровней MeCP2. ECLIA быстро, более чувствительна и проще в обращении по сравнению с другими методами количественной оценки, такими как западная помарка и ELISA. Чтобы подготовить стиральный раствор, который составляет 0,5% Tween 20 в PBS, добавить 500 микролитров Tween 20 на один литр PBS и энергично перемешать.
Подготовь блокирующий раствор 3%Blocker A и PBS и аккуратно перемешайте. Стерилизовать блокирующий раствор путем фильтрации. Для подготовки разбомбительного раствора анализа 1%Blocker A и PBS добавляют пять миллилитров блокирующего раствора в 10 миллилитров PBS.
Следующая оттепель моноклональной мыши анти-MeCP2 антитела на льду. Смешайте 0,67 микролитров антитела с четырьмя миллилитров PBS, а затем вихрь раствора. Чтобы растворить 96-хорошо высокую связующего пластину, тщательно раздайте 25 микролитров раствора покрытия в нижний угол каждой хорошо, используя многоканальный трубоукрыватели.
Dab 96-хорошо пластины мягко с каждой стороны, чтобы убедиться, что покрытие решение охватывает дно каждой хорошо. Печать пластины с клейкой фольгой, и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. Извлеки тарелку из холодильника на 96 колодец и удалите фольгу.
Удалите раствор антитела покрытия в скважинах, щелкивая его в мусорный контейнер. Затем нажмите пластину на бумажное полотенце, чтобы удалить все оставшиеся решения. Далее добавьте к каждой колодец 125 микролитров блокирующего раствора.
Затем снова загерметив тарелку клейкой фольгой. Поместите пластину на орбитальный шейкер микроплея, установленный при 800 об/мин, и инкубировать его в течение 90 минут при комнатной температуре. Оттепель на льду один флакон MeCP2 или Tat-MeCP2 раствора белкового бульона, мышиный мозг лизолирует, и HDF лизолирует.
Разбавить раствор белкового бульона в чистых трубках, как описано в таблице 2 рукописи. Затем разбавить лисат образцов. Для лизайтов мозга мыши используйте от одного до 20 микрограммов на 25 микролитров буфера лиза.
Для лизата HDF добавьте 0,25 к одному микрограмму на 25 микролитров буфера лиза. После того, как пластина из 96 скважин инкубирует в течение 90 минут, удалите блокирующий раствор из колодцев, скулите его в мусорный контейнер. Затем нажмите пластину на бумажное полотенце, чтобы удалить все оставшиеся решения.
Затем трижды промойте тарелку 150 микролитров стирального раствора, добавив раствор для мытья и немедленно удалив его. Добавьте 25 микролитров стандартов и образцов к колодцам пластины из 96 скважин. Печать пластины и инкубировать его в течение еще четырех часов при комнатной температуре с постоянной 800 об /мин встряхивания.
Оттепель неоцеливого антитела обнаружения, поликлональный кролик анти-MeCP2, на льду. Используя разбавляющие раствор анализа, разбавляйте антитела в соотношении от одного до 6000. Когда пластина из 96 колодец будет закончена инкубацией на шейкере, удалите стандарты и образцы, свершив пластину в мусорный контейнер.
Затем нажмите пластину на бумажное полотенце, чтобы удалить все оставшиеся решения. Вымойте тарелку три раза 150 микролитров стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалив его. Добавьте 25 микролитров неолицеприяемого раствора антител обнаружения к каждой колодец с многоканальной трубой.
Печать пластины и инкубировать его в течение одного часа при комнатной температуре с постоянной тряской при 800 об/мин. Получить конкретные вторичные антитела из холодильника и поместить его один лед. Разбавить вторичное тело в анализе разбавляемого раствора и аккуратно перемешать.
Чтобы удалить свободные неоцеливого антитела обнаружения из 96-хорошо пластины, Флик в контейнер для отходов, а затем нажмите пластину на бумажное полотенце. После мытья пластины в три раза, как perviously описано, добавить 25 микролитров вторичных антител к каждому хорошо с многоканальной пипетки. Печать пластины и инкубировать его в течение одного часа при комнатной температуре с постоянной тряской при 800 об/мин.
Удалите свободные вторичные антитела, щелкивая в контейнер для отходов и нажав пластины на бумажное полотенце, а затем мыть пластину три раза, как описано ранее. К каждому колодец пластины добавьте 150 микролитров 1X Tris базы Gold Read Buffer с сурфактантом, содержащим тритропиламин в качестве основногоактанта для легкой генерации. Чтобы избежать производства пузырьков воздуха, используйте методы обратной трубы.
Поместите пластину из 96 колодец на платформу микроплемента с системой обнаружения электрохимилюминесценции. Используя встроенную в CCD камеру, немедленно начните захват данных. Рекордные количество сигналов, которые соответствуют относительным световым единицам и прямо пропорциональны интенсивности света.
Стандартные кривые MeCP2 были получены от человека MeCP2 в нескольких измерениях. ECLIA может точно количественно рекомбинантных человека MeCP2 в диапазоне от одного нанограмма на миллилитр до 1800 нанограмм на миллилитр. Используя ECLIA, уровни белка MeCP2 измерялись в ядерных лизматах мозга от гетерозиготных и женских мышей дикого типа и от одной мыши нокаута MeCP2.
ECLIA была проведена на лицатах клеток от здорового контроля и от c. 806delG клеточной линии, используемой в качестве модели для синдрома Ретта. Нет MeCP2 белка было обнаружено в мутантных клеточных линий ECLIA или иммунофторесценции.
ECLIA был также использован для расследования поглощения Tat-MeCP2 по MeCP2 недостаточной клеточной линии сверхурочных. Точность анализа ECLIA в течение трех дней подряд определялась. Для будущей заместительной терапии белка, MeCP2 доставка может быть неоднократно оптимизирована после оценки уровня белка ECLIA.
