Этот метод может помочь понять ключевые вопросы в области взаимодействия от клетки к клетке, такие как, какие рецепторы являются посредниками в адгезии или распознавании контактов от клетки к клетке и вызывают ли конкретные лиганды их взаимодействия. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет исследовать такие взаимодействия непосредственно в живых клетках без необходимости фиксации клеток или нарушения. Хотя этот метод используется для исследования взаимодействий между культурными клетками, он также может быть применен к другим системам моно мембранных пузырьков или даже небольших модельных организмов.
Как правило, лица, новые для этого метода должны проверить, что их образец достаточно стабилен, чтобы позволить приобретение в течение нескольких минут, тщательно проверяя движение клеток и медленные колебания сигнала. Во-первых, посеять соответствующее количество клеток, по крайней мере в четырех скважинах из шести скважин пластины за день до трансфекции. Культура клеток при 37 градусах по Цельсию 5%углекислый газ в среде DMEM дополняется 10%FBS и 1%L-глутамин.
Для выполнения основного эксперимента трансфект плазмиды для белка интереса сливаются с зеленым или желтым флуоресцентным белком и красным флуоресцентным белком в отдельных скважинах. Через четыре часа удалить рост среды и мыть каждый хорошо осторожно с одним миллилитрОМ PBS дополняется магнием и кальцием снижается PBS на краю хорошо, чтобы предотвратить отслоение клеток во время стирки. Затем удалите PBS.
Добавьте приблизительно 50 микролитров раствора EDTA падение мудрым к каждому хорошо, чтобы облегчить отслоение клеток. После инкубации при 37 градусах по Цельсию в течение двух минут, медленно встряхните шесть хорошо пластины боковой, чтобы отделить клетки. Далее добавьте 950 микролитров среды роста к каждой хорошо и повторно использовать клетки путем трубопроводов несколько раз вверх и вниз, тем самым отделяя все клетки от дна хорошо.
Убедитесь, что клетки перерасходуются должным образом и отсоединяются друг от друга, визуально проверяя на отсутствие больших агрегатов клеток после повторного успения. Перенесите клеточный раствор одного хорошо в соответствующий колодец. Смешайте осторожно по трубе несколько раз вверх и вниз.
Затем семя смешанных клеток на 35-миллиметровой стеклянной нижней блюдо и культуры семенных клеток при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа в течение одного дня. В лазерном сканировании конфокального микроскопа программное обеспечение настроить оптический путь. Чтобы избежать спектрального перекрестного разговора, выберите два отдельных трека для возбуждения и обнаружения mEGFP или mEYFP и mCherry или mCardinal последовательно и выберите Switch треков каждой строки.
Для обнаружения используйте соответствующие фильтры для обоих каналов. Поместите блюдо, содержащее смешанные клетки, на держатель образца. После ожидания 10 минут, чтобы обеспечить эквивалентность температуры и уменьшить дрейф фокусировки, сосредоточьтесь на ячейках, использующих трансмиссионный свет в меню Locate.
Поиск пары красных и зеленых клеток в контакте друг с другом. Затем выберите путь сканирования перпендикулярно контакту от ячейки к ячейке с помощью кнопки Crop. Увеличьте масштаб, чтобы достичь размера пикселя от 50 до 200 нанометров и выберите линию в режиме сканирования.
Установите размер кадра до 128 на один пиксель. Установите скорость сканирования до максимально допустимого значения. Затем установите циклы до 100 000 до 500 000.
После этого выберите соответствующие лазерные силы. Установите детекторы в режим фотон-подсчета. Нажмите Начать эксперимент, чтобы начать приобретение.
Экспорт необработанных файлов данных на изображение RGB TIF в формате необработанных данных. Этот файл будет содержать кимограф с зелеными и красными данными канала в канале, который называют G и R изображения, соответственно. Затем импорт файл TIF с соответствующим программным обеспечением анализа и приступить к проведению анализа.
Выровняй линии, выполняя среднее время сегмента с блоками от 500 до 1000 линий. Определите положение мембраны в каждом блоке. Затем переложить все блоки в одно и то же боковое положение.
Суммировать все выровненные линии вдоль оси времени и соответствовать среднему профилю интенсивности с помощью функции Gaussian. Определите пиксели, соответствующие мембране, как все пиксели в пределах плюс-минус 2,5 сигмы положения мембраны, и подведем итог интенсивности этих пикселей в каждой строке, получая единое флуоресцентное значение сигнала для каждой точки времени. Если наблюдается отбеливание фотографий, нанесите коррекцию отбеливания, уместив серию времени мембраны флуоресценцией с двойной экспоненциальной функцией и применяя соответствующую формулу коррекции.
Рассчитайте функции автоматической и кросс-корреляции в соответствии с соответствующими уравнениями. Для повышения надежности анализа и избегая артефактов выполняются расчеты по 10-20 равным сегментам общего измерения. Проинспектировать функции времени и корреляции флуоресценции в каждом сегменте и удалить четко искаженные сегменты.
Наконец, средние все не искажаемые сегменты. Анализируя данные, тщательно проверяйте сроки интенсивности и функции корреляции из каждого сегмента, чтобы избежать искажений, например, из-за внутриклеточных пузырьков на мембранной периферии. Интенсивность изображения HEK 293T клеток, выражаюющих миристолиированные-пальмитоилированные-mEYFP или mCardinal показано здесь.
Относительная поперечная корреляция близка к нулю наблюдалась в то время как функции автокорреляции показывают характерные времена распада от 10 до 20 миллисекунд для диффузии миристолитарно-пальмитоилированных-mEYFP и mCardinal в плазменной мембране. Кросс-корреляционные функции измерений sFCCS клеток HEK 293T, выражают мембранные гетенодимеры миристолиированные-пальмитоилированные-mCardinal-mEYFP, имели положительные амплитуды и показывали те же времена распада, что и функция автокорреляции. Измерения sFCCS на контактах от клетки к клетке между APLP1-mEYFP и APLP1-mCardinal-выражая клетками привели к положительной относительной перекрестной корреляции 0.45.
Функции корреляции sFCCS, полученные в результате измерений в кластерах APLP1 при контактах клеток-клеток, показали сильно сниженную динамику, о чем свидетельствуют большие периоды распада в колебаниях в большие периоды отставания. При добавлении иона цинка относительная поперечная корреляция увеличилась до среднего значения 0,8. Далее молекулярная яркость значительно увеличилась от мелких олигомеров до больших мультимеров, состоящих из от 10 до 50 мономеров на каждой клетке.
Переходные нестабильности могут привести к кросс-корреляционные функции, имеющие отрицательные значения или высокой ложноположимой кросс-корреляции. Соответствующие функции корреляции обычно сильно отклоняются от функций большинства сегментов. В качестве дополнительного подхода к sFCCS кросс-корреляции число и яркость могут быть использованы для обнаружения белково-белковых взаимодействий.
При попытке этой процедуры важно помнить, что смешивание трансфектных клеток является критическим шагом. Аккуратно смешайте клетки и оптимизируйте эффективность трансфекции, чтобы увеличить вероятность нахождения красных и зеленых клеток в контакте. После его развития этот метод был использован исследователями в области иммунологии для изучения взаимодействий сигнальных молекул в иммунологических синапсах.
