Мы описываем протокол препарирования, иммуноокрашивания и монтирования мозга личинок и взрослых дрозофил с особым акцентом на зрительные доли. Учитывая сложную трехмерную организацию оптической доли, ожидается, что описанный здесь протокол предоставит исследователям лучшее понимание взаимосвязи между ориентацией крепления и визуализируемыми структурами оптических долей. Этот протокол описывает три стратегии крепления как личиночных, так и взрослых зрительных долей, каждая из которых обеспечивает оптимальный угол для визуализации конкретной структуры зрительной доли во время визуализации.
Перед началом вскрытия заполните все лунки трехлуночного планшета 400 микролитрами PBS на лунку и с помощью щипцов аккуратно отоберите 15 блуждающих личинок третьего возраста, ползающих по внутренней части флакона или бутылки дрозофилы. Поместите всех личинок в первую лунку из трех лунок пластины, а одну личинку перенесите в среднюю лунку пластины. Используя недоминирующую руку, зафиксируйте тело личинки у основания лунки и доминирующей рукой осторожно возьмитесь за крючок для рта личинки.
Оттяните крючок для рта в сторону от тела, чтобы удалить мозг. Впоследствии удалите придаточные ткани, в том числе имагинальные диски. Затем поместите мозг в третью лунку тарелки.
Когда все мозги будут препарированы, с помощью пипетки P200 осторожно удалите PBS из третьей лунки, оставив ровно столько раствора, сколько нужно, чтобы мозг оставался погруженным. Добавьте в лунку 500 микролитров свежеприготовленного раствора для холодной фиксации. Аккуратно размешайте раствор щипцами так, чтобы мозг закружился в посуде, и накройте лунку стеклянным предметным стеклом микроскопа.
Затем поставьте блюдо на лед на 30 минут для фиксации ткани. Промойте мозги пять раз 400 микролитрами свежего PBS плюс тритон на одну промывку. Теперь мозг готов к первичной инкубации антител.
При вскрытии мозга взрослых обезболите от 10 до 15 взрослых мух и положите их на лабораторную салфетку со льдом. С помощью щипцов аккуратно перенесите одну взрослую муху за крыло в одну лунку из трех лунок диссекционной пластины, содержащей 400 микролитров PBS. Используйте пару щипцов в недоминирующей руке, чтобы прижать грудную клетку мухи к основанию лунки, и используйте ультратонкие щипцы доминирующей рукой, чтобы мягко оттянуть голову от остальной части тела.
Вылейте тело на салфетку недоминирующей рукой и используйте доминирующую руку, чтобы прижать голову к дну лунки у хоботка. Используйте оба щипца, чтобы отклеить каждую область кутикулы между глазами, пока мозг не обнажится, и удалите все вспомогательные ткани, которые остаются прикрепленными к мозгу. Поместите очищенный мозг в третью лунку и препарируйте следующий мозг, как показано на рисунке, до тех пор, пока не будет получено 15 мозгов или не истечет максимальный период вскрытия в 30 минут.
Зафиксируйте мозги 500 микролитрами раствора фиксации в течение 20 минут при комнатной температуре и промойте мозги пять раз PBS плюс тритоном, как показано. Мозг взрослого человека теперь готов к первичной инкубации антител. Замените последнюю промывку двумя каплями флуоресцентной безопасной монтажной среды, чтобы погрузить мозг, и добавьте одну каплю монтажной среды в центр нового предметного стекла микроскопа.
С помощью щипцов захватите мозг каждой личинки за вентральный нервный канатик для переноса на предметное стекло. Чтобы визуализировать предшественников и нейроны из центральной области внешнего пролиферационного центра, пластинки или дольной пробки, убедитесь, что вентральный нервный канатик выступает над долями, поместите мозг личинки на предметное стекло передней стороной ткани вверх. Чтобы визуализировать клетки, принадлежащие к кончикам внешних или внутренних центров пролиферации, убедитесь, что вентральный нервный канатик выступает из-под долей.
Поместите мозг личинки на предметное стекло задней стороной ткани вверх. Чтобы визуализировать серп нейронов от внутреннего и внешнего центров пролиферации как на дорсальной вентральной, так и на медиальной латеральной оси, используйте пару острых щипцов или вольфрамовую иглу, чтобы разделить доли мозга вниз через вентральный нервный канатик, начиная с точки расщепления между долями. Переориентируйте каждую долю боковой стороной вверх.
Когда мозг личинок будет правильно ориентирован, поместите небольшую каплю монтажной среды по обе стороны от мозга. Положите по одной защитной пластине на каждую каплю и поместите последнюю защитную пластину на мозги так, чтобы правый и левый края опирались на две другие защитные пластинки, образуя защитный мост. Затем используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края крышки скользящего моста, чтобы закрепить установленные мозги.
После последнего вторичного промывки антителами проведите заключительное промывание 400 микролитрами PBS. Замените PBS тремя каплями флуоресцентной безопасной монтажной среды, чтобы погрузить мозг. Добавьте каплю монтажного материала в левую и правую треть предметного стекла стеклянного микроскопа.
Поместите защитную планку на каждую каплю, чтобы построить защитный скользящий мост. Заклейте внешние края правого защитного стекла лаком для ногтей и добавьте одну каплю монтажного материала между защитными стеклами. С помощью щипцов аккуратно перенесите мозги на предметное стекло с особой осторожностью, чтобы не повредить доли зрительного нерва.
Чтобы визуализировать клеточные тела нейронов пластинки и мозгового вещества, используйте вольфрамовую иглу, чтобы ориентировать мозг в переднем положении с выступающими наружу долями антенны. Чтобы визуализировать нейроны комплекса долек, сориентируйте мозг в задней части так, чтобы доли антенн были обращены вниз против положения слайда. Чтобы визуализировать все нейропилы зрительной доли в одной плоскости, сориентируйте мозги в горизонтальном положении, выстройте мозги в переднюю линию, затем с помощью вольфрамовой иглы поверните каждый мозг на 90 градусов вверх так, чтобы он сидел на своей вентральной стороне, опираясь на край покровного стекла.
Когда мозг взрослого человека будет правильно ориентирован, наложите на мозг последний покровный лист так, чтобы правый и левый края перекрывались с двумя другими покровными листами, образуя мост, запечатайте предметное стекло лаком для ногтей. Вот изображение личинки зрительного нерва в передней монтажной ориентации. В передней ориентации эпителий центрального центра громкой пролиферации, нейробласт мозгового вещества и нейроны пластинки появляются на поверхности в виде полос клеток, которые оборачиваются вокруг мозга.
Глубже в мозге, в середине Z-стека, виден эпителий главного внешнего центра пролиферации и соответствующий ему нейробласт и нейроны. Кроме того, в этих промежуточных срезах видны эпителий внутреннего пролиферационного центра и нейроны пробки дольки. Самые глубокие Z-образные срезы изображают другую сторону мозга, где расположены задние кончики внешнего центра пролиферации.
Также присутствует поверхностный кончик внутреннего пролиферационного центра. Обратите внимание, что это были бы первые видимые структуры, если бы оптический лепесток был установлен сзади. Вот изображение с оптического лепестка, установленного на его боку.
На поверхности бокового крепления виден полумесяц пластинки, а между его плечами расположен полумесяц-пробка из дольки. Полумесяц нейронов продолговатого мозга появляется в несколько более глубоком Z-положении. Вот изображение взрослой доли зрительного нерва, установленной в передней ориентации.
Поскольку мозговое вещество расположено на поверхности переднего крепления, кора мозгового вещества видна сразу. Клеточные тела в коре головного мозга проецируют свои арборизации в нейропил, который может быть визуализирован в промежуточном Z-положении. На этом уровне также появляется долька, ориентированная перпендикулярно продолговатому веществу.
В самой глубокой Z-позиции, конечной нейропиле зрительной доли, видна дольная пластинка. Обратите внимание, что дольная пластина была бы первой структурой, видимой в задней части монтировки. Вот изображение взрослого лепестка оптики, установленного в горизонтальной ориентации.
Когда мозг переворачивается на 90 градусов на бок в горизонтальное положение, все нейропили и кора зрительной доли видны в одной плоскости. При выполнении этого протокола самое главное, о чем следует помнить, — это держать ткань мозга погруженной в раствор на протяжении всего протокола. Если мозг подвергается воздействию воздуха, качество пятна и, следовательно, итоговые снимки будут значительно снижены.
Понимание того, как ориентация монтажа влияет на визуализацию оптических лепестков, важно для визуализации в реальном времени. Мозг личинок и взрослых особей можно культивировать и визуализировать в течение нескольких дней, чтобы проследить за делением клеток или изменениями в вашей собственной морфологии. В этом случае ориентация монтажа имеет решающее значение, так как интересующие типы клеток должны находиться близко к покровному скольжению для оптимального обнаружения флуоресцентного сигнала in vivo.
