В этом видео мы будем демонстрировать культивирование эмбриональных крыс'superior цервикальных ганглиев для морфологического и протеомного анализа. Перед началом вскрытия подготовьтесь к средствам контроля и вскрытия. Средства управления содержат F-12 и низким содержанием глюкозы DMEM, дополненные инсулин-селен-трансферрин смесь, глутамин, фактор роста нервов, и BSA.
Среда вскрытия содержит L-15, дополненный ручкой-стрептококк и BSA. Обратитесь к рукописи для подробных протоколов для подготовки средств массовой информации. Подготовка пластин для культивирования нейронов.
Разбавить один миллиграмм на миллилитр запас поли-D-лизина до 100 микрограмм на миллилитр со стерильной дистиллированной водой. Для протеомного или геномного анализа, за один-два дня до вскрытия, пальто шесть хорошо пластин с примерно двумя миллилитров стерильных 100 граммов на миллилитр поли-D-лизина. Это необходимо для обеспечения присадения клеток к колодецу.
Оберните пластины пленкой и храните пластины на ночь при четырех градусах по Цельсию. В день вскрытия, перед началом вскрытия, удалите раствор поли-Д-лизина из колодцев и прополощите скважины пять раз стерильной дистиллированной водой, а затем один раз с низким содержанием глюкозы DMEM. Во время энзиматического пищеварения ганглиев, примерно за час до покрытия клеток, аспирировать DMEM из пластин и заменить его на 0,3 миллилитров контрольной среды.
Храните пластины при 35 градусах Цельсия под 5%CO2 в увлажненной камере. В капюшоне, настроить следующие элементы для вскрытия. Четыре 50 миллилитров стерильных конических трубок с около 20 миллилитров препараторов препарации средств массовой информации в каждой трубке.
Четыре стерильные 35-миллиметровые посуды с 1,5 миллилитров препараторов препараторов. Одна стерильная 50-миллилитровая коническая трубка с 20 миллилитров препараторов препараторов для центрифугации. Одна 15 миллилитровая стерильная коническая трубка для центрифугирования ганглиев, одна стерильная 10 миллилитровая трубка для сбора диссоциированных клеток.
Используйте сухой бус стерилизатор для стерилизации пару тонких типсов, по крайней мере одну минуту. Все процедуры, проведенные в исследованиях с участием животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Колледже Святой Марии в Калифорнии. Руководящие принципы по уходу за животными и их использованию в Калифорнийском колледже Святой Марии были разработаны на основе руководящих принципов, представленных Управлением лабораторного защиты животных в Национальных институтах здравоохранения.
Удаление эмбрионов Е21 у беременной крысы. Обратите внимание, что удаление рога матки может быть выполнено за пределами капота, если окружающая территория тщательно стерилизована. Усытворяйте беременную крысу при вдыхании CO2.
Смять мех из брюшной полости и протрите кожу в области с 70% алкоголя, чтобы стерилизовать его. Используя свежий набор стерильных ножниц и типсов, прорезать кожу, а затем мышцы подвергать рога матки, содержащие эмбрионы. Удалите рог матки с эмбрионами, используя новый набор ножниц и типсов, заботясь, чтобы не повредить кишечник в этом процессе.
Перенесите рог матки с эмбрионами в 150-миллиметровую стерильную чашку Петри и перенесите их в капюшон. Используя новый набор типсов и ножниц, удалить эмбрионы из рога матки и отделить эмбрионы от амниотических мембран и плаценты. Чтобы усытворить эмбрионы, перережьте спинной мозг эмбрионов вдоль средней линии под правой рукой.
Это позволит уменьшить кровотечение из сонной артерии во время удаления SCG. Перенесите эти эмбрионы в подготовленные 50 миллилитровые конические трубки, содержащие средства вскрытия. Убедитесь, что эмбрионы погружены в средства массовой информации.
Каждая трубка может в течение трех эмбрионов. Изоляция высшего шейного ганглиона от эмбриона. Перенесите одного щенка из средств вскрытия на стерильную 150-миллиметровую чашку Петри, наполовину наполненную твердым субстратом с спинной поверхностью на субстрате.
Используя три стерильных 23 калибровочных иглы, приколоть паб к блюду с одной иглой под каждой рукой и третьей иглой через рот, чтобы тщательно hyperextend шеи. Вырезать через кожу в области шеи с помощью стерильных тонких типсов подвергать слюнных желез под ним. Удалите эти железы с помощью тонких типсов.
Найдите стерноклеидомастоид и омохиоидные мышцы вблизи ключицы и трахеи соответственно. Во-первых, сократить поперечные стерноклеидомастоидные мышцы. А затем осторожно сократить тонкие омохиоидные мышцы с помощью тонких типсов.
Как только эти мышцы будут удалены, бифуркация в сонной артерии на передней части, будет видна по обе стороны от трахеи с SCG расположен под этой вилкой в сонной артерии. Используя закрытые типсы, аккуратно поднимите сонную артерию, чтобы визуализировать SCG. Используя один типс по обе стороны от SCG, вытащить сонной артерии и передать его в подготовленные стерильные 35 миллиметров посуды.
Эта ткань, скорее всего, содержат SCG с сонной артерии, блуждающий нерв с кинозной ганглиев, а также другие сегменты мышц или жира в этом районе. Повторите процесс вскрытия с другой стороны. Удалите SCGs из всех эмбрионов, прежде чем продолжить оставшиеся шаги вскрытия изложены.
Распределить изолированные ткани между двумя из 35 миллиметров посуды для облегчения обработки образцов тканей. После обработки SCG. Чтобы отделить SCG от вскрытой ткани, сначала используйте тонкие миппы, чтобы удалить любые посторонние ткани, такие как мышцы или жир, заботясь, чтобы избежать области вблизи сонной бифуркации.
После того, как эти ткани были удалены, два ганглиев видны. Киноз ganglion меньше и круговой в то время как SCG имеет миндалевидную форму. Аккуратно потяните на блуждающий нерв, чтобы отделить блуждающий нерв и кинозные ганглии от сонной артерии, а затем отделить SCG от сонной артерии.
Используйте тонкие типсы, чтобы удалить капсулу, которая окружает SCG. Перенесите SCG на новое 35-миллиметровое культурное блюдо. Повторите этот процесс со всеми вскрытых образцов тканей.
Пальто стерилизованной, хлопчатобумажной стеклянной пипетки с вскрытием средств массовой информации, чтобы предотвратить ткани от прилипления к стенки пипетки. Используйте пипетку, чтобы заменить средства вскрытия стерильными двумя миллилитров коллагеназы типа II, диспазы типа II в кальции и магния, свободной HBSS и инкубировать в течение 50 минут при 37 градусов по Цельсию, чтобы помочь сломать ткани. Обратите внимание, что инкубацио время, возможно, потребуется оптимизировать с различными партиями коллагеназы / диспазы и обычно колеблется от 40 минут до часа.
После инкубации перенесите SCG и коллагеназу/диспас в стерильную 15 миллилитровую коническую трубку. Используйте средства вскрытия для полоскания пластин и передачи раствора в трубку. Добавьте достаточное количество средств вскрытия, чтобы довести громкость примерно до 10 миллилитров.
Центрифуга при температуре 200 х г, от 1000 до 1200 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать образец. Аспирировать супернатанта, заботясь, чтобы не выбить гранулы. Переусердствуйте гранулы с 10 миллилитров препарации средств массовой информации, повторить центрифугации и отказаться от супернатанта.
Заменить от одного до двух миллилитров культуры среды. Используя узкоствольную, согнутую стерильную трубчатую пипетку Pasteur, предварительно покрыть ее культурой среды, механически разобщить сгустки, мягко тримуляции пять-шесть раз. Пусть большие сгустки оседают около одной минуты и передают сверхнатантную подвесную клетку в новую 10-миллилитровую трубку.
Повторите этот процесс еще три раза с возрастающей силой тритурации каждый раз, чтобы обеспечить почти полную диссоциацию SCGs. Передача супернатанта после каждого раунда тритурации в 10 миллилитров трубки с супернатантом от первой тритурации. Добавьте достаточное количество культурных медиа, чтобы довести громкость до 8-10 миллилитров.
Аккуратно смешайте подвеску клетки и количественно плотность клеток с гемоцитометром. Распределив подвеску клетки в скважины при соответствующей плотности клеток для экспериментов. Смешайте подвеску клетки постоянно во время процесса покрытия, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток в скважины.
Для морфологического анализа, пластины клеток около 8000 клеток на колодец в 24-хорошо пластины. А для геномных и протеомных протоколов пластины клеток до 30 000 клеток на колодец. Перенесите пластины в стеклянный децикатор со стерильной водой внизу, чтобы создать увлажняемую камеру.
Ввилите достаточное количество CO2, около 120 миллилитров, чтобы получить 5%CO2 окружающей среды в децикаторе, до уплотнения. Поддерживайте пластины при 35,5 градусах по Цельсию. Это называется нулевой день в протоколе.
Эти пластины также могут поддерживаться в обычном инкубаторе 5%CO2. Описанный выше метод сводит к минимуму изменения температуры и рН, а также помогает предотвратить перекрестное загрязнение. Поддержание культурных нейронов SCG и лечения.
На этих снимках видно разобщенные верхние клетки цервикальных ганглиев в нулевой день, первый день и пятый день. Дневное нулевое изображение показывает ячейки при обливки. Клетки, потроханные на нулевом дне, содержат смесь как нейрональных, так и не нейрональных клеток.
На первый день, через 24 часа после покрытия, тщательно удалить половину культуры средств массовой информации и заменить два микромолара Ара-C, цитозин D-арабинофуранозид, антимитотический агент. Оставьте лечение на 48 часов. Обычно такой продолжительности лечения достаточно для устранения не нейрональных клеток в культуре.
На третий день аккуратно аспирировать половину среды и заменить средством управления. На четвертый день клетки готовы к экспериментальному лечению. Кормите культуры через день соответствующей средой.
Аккуратно заменив половину среды в колодец свежей средой. Картина на пятый день показывает обширный аксональный рост без дендритного роста наблюдается. Чтобы вызвать дендритный рост, нейроны могут быть выращены на Matrigel или лечение 10%сыворотки или 50 нанограмм на миллилитр костного морфогенетического белка-7.
На рисунке два показаны изменения в нейрональной морфологии нейронов E21 крысы SCG после лечения BMP-7. Представитель фазы контраста микрографов на 10 X увеличение показать круговой нейрональной клетки тела с аксонами в контрольных нейронов в панели А, и нейроны с несколькими короткими дендрит-как процессы при лечении с BMP-7 показано стрелками в панели B.Cultured SCG нейронов после соответствующих методов лечения могут быть использованы для морфологического анализа с использованием иммуноцитохимического окрашивания для геномного анализа и для биохимических исследований , например, для протеомных анализов. Обратитесь к рукописи для подробных протоколов для иммуностиминга и подготовки образца для протеомного анализа.
На рисунке 3 показан иммуноуязвим из белка MAP-2 в культурных эмбриональных крысах симпатических нейронов. Панели через D шоу культурных нейронов SCG лечение с помощью средств управления и панелей E через H показать нейронов, обработанных BMP-7 на 50 нанограмм на миллилитр в течение пяти дней. Репрезентативные микрографы, показывающие иммуноцитохимическое окрашивание нейронов микротрубокономным ассоциированным белком-2 в C и G, ядерное пятно в D и H с фазовой контрастной микрографами в B и F, и выйти из трех каналов в A и D.Immunocytochemical окрашивания от микротрубокона связанный белок-2 присутствует в клеточном теле и проксимальных аксонов контрольных нейронов в панели C.And окрашивание из белка MAP-2 в клеточном теле , и дендриты в BMP-7 обработанных нейронов находится в панели G.Here's образец запуска превосходных ганглиев шейки матки лечение с помощью средств управления, которые обнаружили 1100 белков.
Генная онтология с помощью базы данных Panther обнаружила, что большинство белков были цитоплазмическими. Тем не менее, в образце были мембранные белки и белки на клеточных соединениях. Этот анализ также показал, что белки, которые участвуют в широком спектре нейрональных сигнальных путей были обнаружены в образце.
В заключение, после просмотра этого видео, вы должны быть в состоянии изолировать и культуры крыс эмбриональных превосходных нейронов шейного ганглия для морфологического и протеомного анализа. Эта работа финансировалась фондом развития факультета и летней исследовательской программой в Колледже Святой Марии в Калифорнии.
