Первичная культура нейронных клеток является идеальной модельной системой для изучения диссоциированных нейронов в культуре пробирки. Преимуществом использования этого метода является возможность поддерживать клеточные особенности диссоциированных клеток, таких как механизмы, функции и морфология в условиях пробирки в течение нескольких недель как можно ближе к состоянию in vivo. Положите круглую крышку скользит в 24-хорошо пластины под шкаф биобезопасности.
Добавьте 90 микролитров поли-L-орнитина на каждую крышку скольжения. Закройте крышку и аккуратно поместите тарелку в 37-градусный инкубатор на два дня. Подготовь культуру среды и посева среды и держать их на четыре градуса по Цельсию.
Подготовь рабочий трипсин решение в DMEM/F12 и держать его на четыре градуса. Поместите культурную среду и посевную среду в инкубатор при 37 градусах. Возьмите 24-хорошо пластины из инкубатора.
Вымойте крышку скользит три раза с двойной дистиллированной водой. Оставьте крышку скользит, по крайней мере два часа, чтобы полностью высохнуть. Приготовьте три чашки Петри, наполненные холодным PBS, три чашки Петри, наполненные холодным HBSS, и пять чашек Петри, наполненных холодной средой вскрытия на льду.
Акциз рога матки и мыть их в холодной PBS три раза на льду. Отсюда все шаги должны быть проведены на льду, чтобы свести к минимуму повреждения тканей. После последнего шага мытья, отделить щенков от матки в HBSS и передать их в холодную среду вскрытия.
В среде вскрытия обезглавить щенков ножницами. Откройте кальвариум от foramen magnum до нижней границы орбитальной полости. Используя пару тонких типсов, удалите основание черепа и очистите череп от мозга.
Аккуратно удалите околь мозжечка, начиная с боковой поверхности среднего мозжечка и понса. Вырезать как мозжечковые педункулы и отделить мозжечок от остальной части мозга. Немедленно поместите собранную мозжечку в стерильную коническую трубку 15 мл, наполненную DMEM/F12, на льду.
Центрифуга трубки при 1000 г при четырех градусах в течение одной минуты в DMEM/F12. Повторите это три раза, каждый раз аккуратно удаляя супернатант с пипеткой и повторно приостанавливая гранулы в свежем DMEM/F12. Добавьте два миллилитров предварительно разогретого трипсина и аккуратно пипетки, чтобы смешать их вместе.
Поместите трубку в 37-градусную водяную баню на 12 минут. После инкубации, принести трубку в шкаф безопасности и добавить 10 мл DMEM/F12 для инактивации трипсина. Центрифуга смеси на 1200 г в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и заново потух в свежей среде, а затем центрифугации в три раза. Предварительно промокнуть стерильный пластиковый пипетка с DMEM/F2. Добавьте 3,5 миллилитров рабочего раствора DNAse в ту же трубку.
Тритурировать ткани с пипеткой несколько раз, пока жидкость не достигнет однородного молочного цвета. Добавьте в смесь 10 мл холодного DMEM/F12 и перейти к центрифуге. Центрифуга образца при 1200 г при четырех градусах в течение пяти минут.
Аккуратно удалите супернатант, не нарушая гранулы. Удалите среду посева из инкубатора. Добавьте 500 микролитров довоенной среды посева и хорошо перемешайте с помощью пипетки.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Разбавить клеточной суспензией средой посева до плотности 500 000 клеток на миллилитр. Добавьте 90 микролитров смеси к каждой хорошо в центре крышки.
Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах в течение трех-четырех часов. После инкубации добавьте в каждую колодец 500 микролитров предварительной культуры. Замените пластину на инкубатор при 37 градусах.
Через семь дней замените старую среду свежей культурой среды II.Подготовь отдельную 24-хорошую пластину с соответствующей числовой организацией и добавьте 100 микролитров PFA 4% к каждой колодец. После желаемых дней в культуре, аккуратно удалить крышку скользит из колодцев оригинальной пластины культуры и поместить их в соответствующие колодцы пластины PFA описано на предыдущем этапе. Добавьте PFA к скважинам, чтобы полностью погрузить крышку скользит.
Держите пластину PFA на 4 градусах в течение 30 до 120 минут. После инкубации восстановите пластину до комнатной температуры. Вымойте крышку скользит осторожно с PBS в течение пяти минут три раза.
На рисунке два в тексте показана культура мозжечковых клеток, начиная с E18. Иммунофлюоресценция для кальбиндина показывает purkinje нейронов с аксональными расширениями на три дня в пробирке. К семи-десять дней в пробирке, дендритные процессы очевидны.
В 21 день присутствуют сложные дендритные ветви. На рисунке 3 в тексте показаны мозжечковые клеточные культуры, начинающиеся в различные эмбриональные дни. иммунофлюоресценция обнаружения кальбиндина показывает Purkinje нейронов с ранними аксонами только после 18 дней в пробирке.
Пуркинье нейронных культур, начатых на E14 и E15 будет развиваться дендритов, но никогда не так сложно, как те, которые развиваются, когда E18 является отправной точкой. Рисунок 4 в тексте показывает, что различные типы клеток развиваются из культур E18 после 21 дней в пробирке. Calbindin зеленый иммунофторесценции показывает Purkinje нейронов.
Красный иммунофторесценции для парвалбумина в B и C показывают ингибирующие интернейроны. Красный иммунофлюоресценции для натрия напряжения закрытого канала в E и F показывает гранулы нейронов. Нынешний протокол является экономически эффективным и простым в проведении.
В конце этого видео, вы сможете собирать и культуры мозжечковых нейронов и исправить их на желаемых DIVs.
