Этот протокол инкапсуляции свиных яйцеклеток позволяет поддерживать сферическую организацию КОК. Это предотвращает их уплощение и последующее нарушение разрыва между яйцеклеткой и окружающими фолликулярными клетками. Основными преимуществами двух описанных протоколов являются удобные для пользователя и позволяющие эффективно контролировать выживаемость яйцеклеток и клеток химиотерапии.
Обе системы культуры являются ценными инструментами для фундаментальных исследований в области репродуктивной биологии, и могут иметь клиническую значимость для улучшения лечения бесплодия. Они также могут быть применены для разработки новых методов биотехнологии и для улучшения животноводства. После полоскания яичников, перенесите их в стакан, наполненный HM среды и хранить их в инкубаторе при 38 градусов по Цельсию во время всех последующих манипуляций.
Аспирировать фолликулярную жидкость из больших свиных фолликулов и центрифугировать его в 100 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем фильтруйте супернатант с помощью стерильного шприца, прикрепленного к фильтру пор мембраны 0,2 микрометра, и замяйте его при отрицательном 80 градусах по Цельсию. Чтобы изолировать COCs от средних фолликулов, перенесите два-три яичника в стерильную 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную HM. Аккуратно вырежьте поверхность выступающих фолликулов яичников стерильным хирургическим лезвием номер 15, что приведет к тому, что фолликулярная жидкость и КОК вытекают в чашку Петри.
Аспирировать фолликулярное содержимое с помощью 28 калибровочных игл, прикрепленных к одноразовому шприцу, и перенести его в другую чашку Петри. Для приготовления блюд ЭКО Петри добавьте один миллилитр HM в центральные скважины и поместите три-четыре капли HM во внешние кольца. Затем используйте поликарбонатный микропайп, чтобы переместить неповрежденные COCs к каплям HM во внешних кольцах, и кратко промыть их три-четыре раза.
Когда закончите, индивидуально перенесите их в центральную колодец. Храните пластины ЭКО в инкубаторе. Подготовка тромбина и фибриногенных решений, описанных в текстовой рукописи.
В день процедуры медленно оттаивать фибриногенный раствор на льду, и довести его до комнатной температуры прямо перед использованием. Смешайте 0,5%альгинатный раствор и раствор фибриногена при соотношении один к одному для конечного объема в два миллилитров и аккуратно вихрем смеси. Ремонт инкубационых камер, применяя тонкие полоски парафиновой пленки к стеклянным слайдам микроскопа.
Pipette 7.5 микролитровые капли смеси FA на парафин пленкой покрытием стеклянная горка с отделяющейся спейсеры, размещение от восьми до 10 капель расположены в два ряда. Используйте микропипюту для переноса трех-пяти КОК в центр падения FA, а также минимального объема среды созревания. Добавьте 7,5 микролитров раствора тромбина поверх каждой капли FA, чтобы покрыть его.
Там нет необходимости смешивать их, потому что гель образуется почти мгновенно. Обложка инкубационой камеры с ранее подготовленным стеклянным слайдом, затем поверните камеру вверх дном и поместите его в 100-миллиметровую чашку Петри, облицованную влажной фильтровальной бумагой. Положите чашку Петри в 5%углекислый газ при 38 градусах по Цельсию инкубатор в течение пяти-семи минут.
После инкубации перенесите каждую капсулу FA в колодец из 96-хорошо пластины, содержащей 100 микролитров среды созревания. Каждые два дня, заменить половину среды со свежими предварительно equilibrated созревания среды. Изображение COC использует перевернутый световой микроскоп при увеличении в 10 раз.
После культивирования COCs в течение четырех дней, удалить среды созревания из скважин и добавить 100 микролитров 10 международных единиц на миллилитр алгенат лизат в DMEM. Оставьте культурную тарелку в инкубаторе на 25-30 минут. Удалите COC из растворенных капсул.
Вымойте их в DMEM несколько раз, а затем передать их на внутреннее кольцо БЛЮДО ЭКО, содержащее PBS. Сделайте кровать из пяти граммов порошка FEP в 30-миллиметровой чашке Петри. Распределив одну каплю среды созревания, содержащую от трех до пяти КОК, на порошок FEP.
Поверните пластину мягко круговыми движениями, чтобы частицы полностью покрывали поверхность жидкой капли и образовыывали жидкие шарики, или LMs. Приготовьте несколько 60-миллиметровых блюд IVF Petri и добавьте три-четыре миллилитров стерильной воды во внешние кольца для создания камеры влажности. Возьмите сформированный LM с 1000 микролитровой пипеткой и поместите его в центральную колодец.
Инкубировать шарики в течение четырех дней при 38 градусах по Цельсию в пятипроцентный инкубатор двуокиси углерода. Чтобы изменить среду, нанесите 30 микролитров среды созревания на каждый LM, что приведет к его распространению. Когда содержимое мрамора растворится, перенесите coCs, выпущенные из биореа реактора, в каплю свежей среды созревания в чашке Петри.
После трех-четырех моет в среде созревания, передачи COCs, вместе с 30 микролитров свежей среды, на FEP порошок кровать. Аккуратно поверните пластину круговыми движениями, чтобы частицы порошка полностью покрывали поверхность жидкой капли и образовыв новый LM.Then, перенесите LM в блюдо ЭКО Петри. Обе системы созревания in vitro производили COCs с гранулозными клетками, которые были плотно прилипнуты друг к другу и нетронутыми слоями кучевых клеток.
Анализ жизнеспособности COC подтвердил, что оптимальные условия роста были достигнуты в обеих системах инкапсуляции. В обеих группах наблюдались только участки ооцитов высокой жизнеспособности. Ооциты были изображены с помощью электронной микроскопии передачи.
Митохондрии были равномерно распределены и имели оболочку, как форма. Лишь немногие из них были вытянуты, и их кластеризация периодически наблюдалась. Эндоплазмический ритикулум был либо связан с митохондриями, либо свободен в цитоплазме яйцеклеток.
Ликвидные капли появились как маленькие, темные, круглые структуры, и аппарат Golgi были появились с расширенными цистернами. Важно быть точным и осторожным при передаче капсул ФА из инкубационой камеры в культурные пластины и при подборе и передаче формата LM в блюдо ЭКО Петри.
