В этом протоколе мы демонстрируем эффективную процедуру изготовления высокооткрытых пористых микросфер на основе PLGA, которые предлагают несколько преимуществ, таких как удобство упаковки клеток, улучшенное удержание клеток и минимальная инвазивность. Полученные в результате монодисперсные высокооткрытые пористые микросферы на основе PLGA обладали размерами частиц около 400 микрометров и открытыми порами около 50 микрометров с соединительными окнами для повышения эффективности удержания клеток. Эти минимально инвазивные микроносители могут поддерживать платформу сложной 3D-модели опухоли для скрининга лекарств и легких инструментов для построения микротканей, нагруженных клетками, для регенерации тканей.
Такой подход довольно прост, так как микрофлюидное устройство может быть собрано из поливинилхлоридной трубки, стеклянного капилляра и иглы. Продемонстрировать процедуру будет Шэн-Чан Ло, докторант лаборатории. Начните с создания копоточного микрофлюидного генератора с использованием стеклянного капилляра, поливинилхлоридных трубок и дозирующей иглы 26 калибра.
Затем соедините стеклянный капилляр с концом трубки из поливинилхлорида и проткните соединение между ними иглой. Для генерации капель поместите другой конец трубки поливинилхлорида в непрерывную фазу и отверждайте ультрафиолетовым клеем, чтобы запечатать зазоры в соединении. Теперь возьмите шприц объемом 50 миллилитров для загрузки непрерывной фазы и шприц из пяти миллилитров для образования эмульсии.
Затем устанавливают скорость потока непрерывной фазы на уровне двух миллилитров в минуту, а фаз дисперсии на уровне 0,08 миллилитра в минуту. Поместите стакан объемом 500 миллилитров в ледяную ванну и наполните его предварительно охлажденным водным раствором поливинилового спирта. Для приготовления эмульсии немедленно декантируют водный желатиновый раствор в раствор DCM PLGA и эмульгируют с помощью ультразвукового устройства.
Затем отрегулируйте ультразвуковую мощность до 400 Вт, а общее время обработки до 90 секунд, и постоянно меняйте положение зонда вручную. Стабилизируйте полученную эмульсию для отсасывания шприца и образования капель примерно через 20 минут. После ультразвуковой обработки быстро загружают приготовленную эмульсию в пятимиллилитровой шприц в микрофлюидной платформе и вводят нестабильную эмульсию водяного масла в микрофлюидное устройство в виде прерывистой фазы.
Одновременно используют водный раствор поливинилового спирта в качестве непрерывной фазы. После введения соответствующих порций эмульсии в микрофлюидное устройство соберите микросферу, содержащую эмульсию, в нижней части собирающего стакана и поместите образец при четырех градусах Цельсия на ночь для дальнейшей стабилизации. Нормализуйте хранящиеся микросферы до комнатной температуры и устраните остаточный DCM путем перемешивания стеклянным стержнем в течение одного часа при 60 об/мин.
Затем тщательно декантируйте фазу сбора в стакан объемом 500 миллилитров и трижды смойте остаточный поливиниловый спирт с поверхности пористых микросфер деионизированной водой. Растворите желатин, обернутый в основу PLGA, поместив микросферы PLGA на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем удаляют остаточный желатин, промыв образующиеся микросферы деионизированной водой дважды, и предварительно охлаждают для лиофилизации при минус 80 градусах Цельсия в течение 24 часов.
Высокооткрытые пористые микросферы на основе PLGA отображали размеры от 350 до 500 микрометров с произвольным размером пор от 10 до 100 микрометров и взаимосвязанными окнами, которые могли бы способствовать высокой эффективности транспортировки отходов метаболизма кислорода. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, культивируемые в высокооткрытых пористых микросферах на основе PLGA, прилипали к каркасам за один день, представляя обширные адгезионные и миграционные возможности клеток. Окрашивание кальция-АМ и йодида пропидия показало, что клетки живы и распределены равномерно.
Важно установить ультразвуковую мощность и положение зонда. Воспроизводимое производство высокооткрытых пористых микросфер на основе PLGA проложит путь к построению готовых графиков, чтобы вызвать регенерацию или скрининг лекарств.
