Этот протокол описывает уникальную экспериментальную модель тиковых расстройств, излагая метод индуцирования двигательных тиков у свободно ведящей себя крысы, либо преходящим, либо хроническим образом. Основным преимуществом данного метода является то, что он описывает единственную доступную модель тиковой экспрессии, которая широко используется для изучения синдрома Туретта и других тиковых расстройств. Визуальная демонстрация проясняет сложный процесс подготовки и имплантационной хирургии.
Продемонстрировать процедуру будут Эстер Виннер, аспирантка моей лаборатории, и Катя Белеловски, заведующая лабораторией. Для начала подготовьте канюлю имплантата, разрезав гипотрубку из нержавеющей стали 25 калибра и съемную внутреннюю проволоку 0,013 дюйма. Вставьте этот муляж проволоки в канюлю имплантата, пока она не достигнет конца, и согните лишнюю проволоку.
Затем вырежьте 70-сантиметровую гибкую полимерную микроборную трубку для подготовки инжектора. Подготовьте инъекционную канюлю, разрезав гипотрубку из нержавеющей стали 30 калибра вращающимся инструментом. Вставьте три миллиметра этой инъекционной канюли в гибкую трубку и склейте стык между ними, чтобы получить инжектор.
При выполнении операции сдвиньте имплантат канюляра на держатель канюли и опуньте его до цели имплантации в мозге крысы. Прикрепите имплантированную канюлю к черепу крысы, применив зубной цемент. Вставьте подготовленный манекен в эту канюлю имплантата и покройте все имплантаты, нанеся зубной цемент на остальную часть области черепа.
Для выполнения микроинъекции прикрепите инжектор к прецизионному стеклянному микрошприцу, заполненному бикукультином, и настройте параметры со скоростью 0,35 микролитра в минуту и общим объемом 0,35 микролитра. Поместите крысу в экспериментальную клетку. Извлеките манекен и вставьте инжектор в имплантированную канюлю через конец.
Запустите инфузионную насосную машину и отслеживайте время инициации и окончания тик с помощью секундомера. После одной минуты инъекции извлеките инжектор и медленно вставьте манекен. Подготовьте направляющую канюлю, разрезав 12-миллиметровую гипотрубку из нержавеющей стали 25 калибра и инфузионную канюлю, разрезав гипотрубку из нержавеющей стали 30 калибра.
Вставьте проволоку диаметром 0,005 дюйма в инфузионную канюлю и согните ее в L-образную форму в предполагаемом месте. Далее подготовьте гибкую катетерную трубку, разрезав восьмисантиметровую полиэтиленовую трубку PE10. Снимите внутреннюю проволоку с инфузионной канюли, приклейте направляющую канюли на трехмиллиметровое перекрытие возле изогнутой части инфузионной канюли с помощью цианоакрилатного клея и ускорителя.
Затем вставьте горизонтальную часть инфузионной канюли на катетерную трубку. Извлеките полупрозрачную крышку замедлителя потока насоса. Погрузите адаптер трубки в 70% спирт и прикрепите его к короткой части канюли замедлителя потока, пока он не коснется белого фланца.
Вставьте гибкую трубку катетера в адаптер трубки и удерживайте ее длинную часть канюли с помощью зажимной подставки, склеивая все соединения. Оберните мини-осмотический насос бумажной салфеткой и зафиксируйте его вертикально отверстием, обращенным вверх, с помощью подставки для держателя зажима. Наполните насос aCSF с помощью шприца с тупой иглой 27 калибра, заботясь о том, чтобы избежать попадания воздуха.
Заполните длинную часть канюли инфузионной трубки aCSF с помощью шприца с тупой иглой 27 калибра. И вставьте его в насос. Поместите насос в солевой пакет на срок не менее четырех-шести часов при 37 градусах Цельсия.
Создайте подкожный карман в спине крысы, альтернативно открывая и закрывая стерилизованный спиртом гемостат под кожей через среднюю лопаточную линию. Снимите насос с водяной бани и поместите его на спину крыс, покрытую бумажной салфеткой. Скользите этой канюлью направляющей инфузионной трубки на держателе канюли.
Удерживайте насос с гемостатом и аккуратно вставьте его в подкожный карман. Имплантировать инфузионную канюлю в мишень и приклеить ее к черепу с помощью гелевого клея. Зафиксируйте инфузионную канюлю, убедитесь, что катетер не изгибается, чтобы обеспечить движение шеи, и покройте все имплантаты зубным цементом.
Чтобы выполнить операцию по замене насоса, начните вводить бикукульт в насос с помощью шприца с тупой иглой 27 калибра. Продолжайте вводить бикукультин, снимая шприц, чтобы предотвратить попадание воздуха. Вставьте замедлитель потока внутрь насоса и поместите насос в солевой замок на не менее четырех-шести часов на водяной бане с 37 градусами Цельсия.
Сделайте разрез на коже над имплантированной помпой. Вымойте карман при комнатной температуре aCSF и высушите его марлевыми подушечками. Отсоедьте наполненный aCSF насос от замедлителя потока с помощью гемостата и выбросьте его.
Аналогичным образом отсоедьте и отбросьте замедлитель потока от насоса, заполненного бикукуллинами. Аккуратно прикрепите заполненный бикукуллином насос к имплантированному замедлительу потока и склейте линию разреза тканевым клеем. В острой модели тики начинают появляться через несколько минут после бикукуллинной микроинъекции и длятся в течение десятков минут, а затем в конечном итоге распадаются и прекращаются.
В хронической модели тики обычно начинают появляться в первый день после имплантации насоса, заполненного бикукуллинами, который колеблется в течение дня и наиболее четко наблюдается во время спокойного состояния бодрствования. Моторные тики имеют стереотипную кинематическую сигнатуру, которая может быть обнаружена в сигналах акселерометра и гироскопа. Аналогичным образом, тик-тайминг также может быть оценен с использованием потенциального сигнала локальных полей по всему пути кортико-базальных ганглиев из-за появления переходных всплесков LFP большой амплитуды.
Эти модели позволили изучать экспрессию тиков после различных поведенческих, экологических и фармакологических вмешательств в течение длительных периодов времени.
