A.J.C, J.A.T и I.L признают финансирование со стороны Европейской комиссии через проект Horizon 2020 ACEnano (Грант No. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z признает финансирование PhD от Китайского стипендиального совета (CSC, No 201507060011). R.R признает финансовую поддержку схемы грантов Vidi Нидерландской организации научных исследований (NWO Vidi 723.0160330).

Использование биожидкости человека было одобрено в соответствии с руководящими принципами протокола IRB от Лейденского университета и Медицинского университета Инсбрука. Когда исследуются биожидкие животные или животные, требуется этическое одобрение от научно-исследовательского учреждения, которое было получено в случае результатов, показанных в этом протоколе. Кроме того, следует также представлять надлежащую отчетность для обеспечения прозрачности и возможности повторного использования данных в будущей работе9,29,30.
1. Получение фоновых электролитов (БГЭ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворители должны быть приготовлены в подходящем вытяжном вытяжке, и для всех этапов должны использоваться соответствующие средства индивидуальной защиты (лабрадор, перчатки и очки). На каждом этапе требуются пластиковые флаконы с низким связыванием, чтобы свести к минимуму потерю анализируемого вещества и загрязнение образца солями, выщелачиваемыми из стеклянной посуды.
<ol><li>Готовят 10% уксусной кислоты BGE (v/v), pH 2,2 на ежедневной основе для метаболомики.<ol>
<li>В объемную колбу объемом 10 мл добавляют 1 мл уксусной кислоты с последующим добавлением деионизированной (DI) воды к маркированной линии и тщательным перемешиванием.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Готовят 100 мМ уксусной кислоты, рН 2,9 на ежедневной основе для протеомики.<ol>
<li>В объемную колбу объемом 10 мл добавляют 57 мкл уксусной кислоты с последующим добавлением воды DI к отмеченной линии и тщательным перемешиванием.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Подготовка НМ
<ol><li>Энергично рассеивайте НМ в воде, используя опубликованные руководящие принципы31,32,33. ПРИМЕЧАНИЕ: При разработке этого протокола 7 НМ использовались следующим образом: 100 и 1000 нм карбоксилированный полистирол использовались для белка и метаболита короны соответственно. 100 нм немодифицированный полистирол НМ НМ, 13 нм анатаза TiO2 НМ, которые были немодифицированы или покрыты полиакрилатными или PVP полимерами, и 22 нм немодифицированные SiO2 НМ использовались как для белковых, так и метаболитных корон. Хотя метод был разработан и продемонстрирован с использованием этих НМ, следует отметить, что этот подход будет применим к широкому спектру НМ композиций, размеров, форм и морфологий НМ.</li>
	<li>Охарактеризовать размер частиц с помощью динамического рассеяния света34,35,масс-спектрометрии плазменной с индуктивной связью с одной частицей36,анализа отслеживания наночастиц37или просвечивающей электронной микроскопии и поверхностного заряда в качестве дзета-потенциала с использованием дзета-сизера34.</li>
</ol>3. Биомолекулярное коронообразование
<ol><li>Разделение 2 мл плазмы человека (или биожидкости выбора) на 1 мл аликвоты, одна для метаболита и белковой короны, а вторая для характеристики метаболома плазмы.</li>
	<li>Инкубировать 1 мг/мл НМ в плазме человека в течение 1 ч при 37 °C, осторожно перемешивая при 500 об/мин в термомиксе. После инкубации центрифугируют образец при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °C для гранулирования НМ.</li>
	<li>Соберите супернатант плазмы для анализа короны метаболита. Сохранить коронный комплекс NM-белка для характеристики белковой короны.</li>
</ol>4. Выделение белковой короны
<ol><li>Повторно суспендируют NM-белковый комплекс (гранулу) в 1 мл 10x PBS Buffer и энергично вихряют в течение 2 мин для удаления несвязанные белки. Центрифугировать раствор PBS при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °C до гранул НМ и осторожно удалить супернатант, не нарушая гранулу.</li>
	<li>Повторно суспендируют гранулу в 1 мл буфера бикарбоната аммония (ABC) (100 мМ, рН 8,0) и энергично вихрь в течение 2 мин для удаления несвязанные белки и нежелательные соли. Центрифуга при 4 000 х г в течение 15 мин при 4 °C для гранулирования НМ; удалить и выбросить супернатант. Повторите этот шаг.</li>
	<li>Уменьшают белковые дисульфидные связи путем растворения гранул NM-белка в 20 мкл буфера ABC (100 мМ рН 8), содержащего 10 мМ дитиотеритол. Инкубировать восстановительный раствор в течение 30 мин при 56 °C.</li>
	<li>Для переваривания белков добавляют 2 мкг секвенирования трипсина к 20 мкл ABC, содержащего 0,1% поверхностно-активного вещества. Инкубировать раствор для переваривания в течение 16 ч при 37 °C.</li>
	<li>Алкилат образца путем добавления 20 мкл йодоацетамида при 55 мМ в 100 мМ АВС и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.</li>
	<li>Добавьте 20 мкл 0,1 М HCl для расщепления поверхностно-активного вещество и оставьте на 10 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>Обогащайте и обессоливайте пептиды с помощью упакованного в упаковку C18 наконечника опреснителяющей пипетки.<ol>
<li>Смочите наконечник 80 мкл 0,1% муравьиной кислоты 50% ацетонитрила 5 раз, очистите 80 мкл 0,1% муравьиной кислоты 5 раз, вытяните и пролейте образец 10 раз, обессоливание образца промывкой 80 мкл 0,1 % муравьиной кислоты 5 раз и элюлирование образца 2 раза 80 мкл 0,1% муравьиной кислоты 70% ацетонитрила в чистую низкосвязывающую ПЦР-трубку.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Лиофилизируйте образцы и храните при -20 °C до анализа.</li>
</ol>5. Выделение метаболита короны
<ol><li>Возьмите контрольную плазму и супернатант из инкубации плазмы NM с шага 3.3 и держите на льду во время пробоподготовки.</li>
	<li>Возьмите по 50 мкл с каждого в отдельные флаконы и разбавьте 1 из 10 водой DI. Возьмите 50 мкл каждого разбавленного образца и переместите в новые флаконы для шага 5.3.</li>
	<li>Добавьте 200 мкл хлороформа, 250 мкл метанола и 350 мкл DI воды и энергично вихревой смеси в течение 2 мин. Центрифуга в течение 10 мин при 20 800 х г при 4 °C.</li>
	<li>Возьмите 500 мкл супернатанта и процедилите через центробежный фильтр 3 кДа в течение 2 ч при 10 000 х г при 4 °C. Возьмите 430 мкл ультрафильтрата и высушите в вакууме со скоростью. Образцы теперь могут быть заморожены перед анализом.</li>
</ol>6. Подготовка системы CESI-MS38
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед установкой капилляров убедитесь, что входной и выходной конц капилляров неповреждены и что в капилляре нет видимых поломок.
<ol><li>Установка капилляра с нейтральным покрытием для анализа белковой короны39.<ol>
<li>Поместите новый капилляр с нейтральным покрытием (длиной 90 см и внутренним диаметром 30 мкм) в прибор CESI в соответствии с рекомендациями производителя.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовка капилляров CESI к протеомическому анализу.<ol>
<li>Промывайте капилляр отделения в прямом направлении, используя 100 мМ HCl в течение 5 мин при 100 фунтов на кв. дюйм, и проверьте образование капель на выходе из капилляра. Промывка капилляра разделения С BGE при 100 psi в течение 10 мин, а затем DI вода при 100 psi в течение 30 мин (это требуется только для новых капилляров).</li>
		<li>Промывайте капилляр разделения и проводящий капилляр BGE при 90 psi в течение 5 минут и убедитесь, что капли образуются на выходном конце обоих капилляров.</li>
		<li>Промыть капилляр отделения водой DI при 90 psi в течение 10 мин, затем 50 psi в течение 10 мин с 0,1 M HCl, затем снова 90 psi в течение 10 мин с водой DI и, наконец, BGE при 90 psi в течение 10 мин. Соедините CESI с MS с помощью источника нанораскрытия и адаптера, как описаноранее 38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Установка голого плавленого капилляра кремнезема для характеристики метаболита короны38.<ol>
<li>Поместите новый голый плавленый капилляр кремнезема (длиной 90 см и внутренним диаметром 30 мкм) в прибор CESI в соответствии с рекомендациями производителя.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовка капилляров CESI для метаболомического анализа.<ol>
<li>Промывайте капилляр отделения в прямом направлении, используя 100% MeOH при 50 psi в течение 15 мин и проверьте образование капель на выходе из капилляра. Промывайте как капилляр разделения, так и проводящий капилляр BGE при 90 psi в течение 5 мин и обеспечьте образование капель на выходе из обоих капилляров.</li>
		<li>Промыть капилляр отделения водой DI при 90 фунтов на кв. дюйм в течение 10 мин, затем 50 фунтов на кв. дюйм в течение 10 мин с 0,1 М NaOH, затем снова 90 фунтов на кв. дюйм в течение 10 мин с водой DI и, наконец, BGE при 90 фунтов на кв. дюйм в течение 10 минут. Соедините CESI с ESI-MS с помощью источника нанораспролив и адаптера, как описано ранее. 38 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS для анализа белковой короны
<ol><li>Повторное суспендировать образцы со ступени 4,8 в 20 мкл 50 мМ ацетата аммония рН 4,0.</li>
	<li>Выполните 5 psi 10 с гидродинамической инъекции образца. Отделяют с помощью напряжения разделения 30 кВ со следующим градиентом давления: 0-10 мин при 1 psi, 10-35 мин при 1,5 psi и 35-45 мин при 5 psi с использованием 100 мМ, рН 2,9 уксусной кислоты в виде BGE.</li>
	<li>Собирайте масс-спектры в зависимости от 250-2000 м/з с помощью 10 данных, зависящих от фрагментации.</li>
	<li>Между образцами промывайте капилляр 0,1 M HCl в течение 3 мин при 100 psi и 10 мин 100 psi BGE для разделения капилляра и в течение 3 мин при 100 psi для проводящего жидкого капилляра.</li>
</ol>8. CESI-MS для анализа короны метаболита
ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы должны быть проанализированы дважды, один раз в положительном режиме для обнаружения катионов и один раз в отрицательном режиме для обнаружения арионов. Контрольные образцы плазмы должны быть проанализированы не менее 5 раз.
<ol><li>Повторно суспендирует НМ облученные и неэкспонированные образцы плазмы со ступени 5,4 в 430 мкл воды DI и энергично вихрь в течение 2 мин. Фильтр через мембранный фильтр 0,1 мкм.</li>
	<li>Возьмите 95 мкл фильтрата и добавьте 5 мкл внутренних эталонов при 200 мкМ для катионов (L-метионинсульфон) и 400 мкМ для ангонов (2,2,4,4-D4-лимонная кислота) и энергично вихрь. Центрифуга при 4 000 х г при 4 °C в течение 10 мин до анализа CESI-MS.</li>
	<li>Впрыскивайте образец гидродинамически в течение 30 с (катионов) и 40 с (ангонов) при 2 psi.</li>
	<li>Разделяют метаболиты в 10% уксусной кислоты с напряжением разделения 30 кВ в прямом (катионы) и обратном (анионы) режиме. Режим обратного разделения необходим при прямом давлении 0,5 psi на капилляр разделения.</li>
	<li>Установка масс-спектрометра для сбора данных в положительном (катионы) или отрицательном (ания) режиме в диапазоне масс 65-1000 м/з. Между образцами промывайте капилляр 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, водой DI и BGE при 50 фунтов на кв. дюйм в течение 2 мин.</li>
</ol>

J.A.T является сотрудником AB Sciex UK Ltd, которые участвуют в качестве отраслевого партнера в проекте ACEnano, J.A.T и все другие авторы не имеют конфликта интересов в этой работе.

Это первый способ, предложенный для характеристики полной биомолекулярной короны, включающей белки и метаболиты, из одного образца, с использованием CESI-MS. Способность характеризовать как белки, так и метаболиты из одного и того же образца значительно увеличит объем данных, собранных в результате одного экспериментального воздействия, что позволит по-новому познать процесс формирования короны и его влияние на токсичность и эффективность НМ в качестве нанолечащих средств. Кроме того, CESI-MS является идеальной платформой для характеристики обоих классов биомолекул с необходимым изменением капилляров. Двигаясь вперед, новые методы, разработанные для невозгодных CE, позволят выполнять липидомику с использованием CE-MS40, таким образом, теперь можно анализировать белки, метаболиты и липиды с использованием единой платформы. Нынешние традиционные подходы потребуют двух специализированных платформ LC-MS, одна для белковой короны и одна для метаболитовой короны. Таким образом, такой подход позволяет собирать в два раза больше данных с помощью единой аналитической платформы.
Есть некоторые предостережения к этому подходу, особенно с метаболитной короной, поскольку этот протокол предлагает косвенное измерение короны. Таким образом, проблема может возникнуть, когда уровни метаболитов присутствуют в высоких концентрациях по отношению к НМ и последующее падение концентрации метаболитов в матрице невелико. Однако, в отличие от белковой короны, маловероятно, что будет разработан подход «один размер подходит всем» к выделению метаболитовой короны из-за того, что каждый НМ имеет уникальную поверхностную химию. В дальнейшем более вероятно, что НМ-специфические подходы к выделению метаболитовой короны будут разработаны и проверены; это будет применимо только к этому конкретному НМ. Несмотря на это, CESI-MS по-прежнему будет очень подходящей платформой для характеристики полярных заряженных метаболитов независимо от того, как они выделены. Также следует отметить, что если гранула не образуется на этапах центрифугирования, предназначенных для гранулирования НМ, может потребоваться более высокая центробежная сила; это, скорее всего, произойдет с менее плотными НМ. Также крайне важно, чтобы все этапы фильтрации соблюдались в рамках протокола из-за узкого отверстия капилляров, которые могут легко блокироваться, если какие-либо твердые частицы не были адекватно удалены из образца.
В то время как белковая корона была интенсивной областью исследований в течение ряда лет, способность сочетать ее с метаболитной короной является новой областью интересов для ученых, изучающих био-наноинтерфейс6,14. На сегодняшний день большинство этих исследований сосредоточено на неполярной, липидной фракции метаболита короны9,28. Этот современный метод позволяет охарактеризовать высокополярные и заряженные метаболиты в короне, которые включают важные метаболиты, участвующие в энергетическом метаболизме, гликолизе и синтезе ДНК. В результате в сочетании с рабочим процессом протеомики возможна более целостная характеристика биомолекулярной короны. Это позволяет проводить более глубокий анализ био-нано взаимодействий в будущем. Этот метод позволяет улучшить механистическое понимание рецептор-опосредованного эндоцитоза через белковые и метаболитные взаимодействия с мембранными рецепторами. Кроме того, могут быть изучены меж- и внутрикоронакоронные взаимодействия между белками и малыми молекулами; например, недавно было показано, что белки в короне играют ключевую роль в рекрутации метаболитов15. Стоит отметить, что репрезентативные результаты на фиг.3 и Фиг.4 являются абсолютной количественной оценкой метаболитов, однако нецелевой подход с использованием многомерного анализа данных для сравнения всех признаков CE-MS в контрольной части по сравнению с облученной плазмой также прояснил бы связывание метаболитов. Таким образом, существует значительная область для изучения того, как и какие метаболиты и белки влияют на их соответствующую рекрут в КОРОНЫ НМ. Эти дополнительные исследования могут помочь разработать короны для оптимизации доставки нанолечебных препаратов или выявить дальнейшие препятствия на пути их развития, такие как подавление фармацевтического действия из-за функций блокировки или маскировки биомолекулярной короны.
CESI-MS с его наномасштабной скоростью потока около 20 нл / мин и минимальным использованием органических растворителей предлагает улучшение зеленых и экономических характеристик по сравнению со стандартными LC-MS и nanoLC-MS с точки зрения использования растворителей, основных проблем для метаболомических и протеомических исследований, соответственно. CESI-MS предлагает высоковоспроизводимые результаты как для времени миграции, так и для пиковой области, которые выгодно отличаются от методов11, 15наоснове LC-MS. Кроме того, по сравнению с nanoLC-MS, перенос не является проблемой в CESI-MS. Таким образом, не требуется обширная очистка системы между анализами образцов, что значительно повышает пропускную способность образца11.
Таким образом, предлагаемый рабочий процесс является первым, в ком подробно описывается подход к характеристике как белковых, так и метаболитных компонентов полной биомолекулярной короны НМ. Это открывает новый аспект био-нано взаимодействий, метаболитную корону, что позволяет сбор в два раза больше данных из одного образца, что позволяет более полно понять взаимодействия на био-наноинтерфейсе.

Био-нано взаимодействия, на границе раздела между поверхностями наноматериала (НМ) и биологическими матрицами, из которых биомолекулы адсорбируются к НМ, являются интенсивной областью исследований, лежащей в основе нанобезопасности и наномедицины1. Этот слой адсорбированных биомолекул придает биологическую идентичность НМ, таким образом, клетки идентифицируют их как «себя», впоследствии влияя на клеточное поглощение, распределение и биологические конечныеточки 2,3,4. Подавляющее большинство био-нано исследований были сосредоточены на белках в короне и продемонстрировали, что белки количественно и качественно различаются между НМ разного состава5. Это изменение зависит как от свойств НМ, таких как размер, функционализация и материал, в дополнение к свойствам биологической матрицы, включая состав и содержание соли5. Растущей областью интереса к био-наноинтерфейсу являются метаболиты, которые адсорбируются к НМ6. Несколько исследований показали, что, как и в отношении белков, свойства NM являются ключевым фактором в определении состава метаболитов в короне и что они могут влиять на биологические результаты воздействия NM6,7,8.
В исследованиях биомолекулярной короны выделяют четыре различные фазы ее характеристики: коронообразование, выделение биомолекул внутри короны, их обнаружение с помощью качественной или количественной масс-спектрометрии и идентификация9. На сегодняшний день был принят ряд методов для выделения белковой короны, включая кипячение в буфере SDS-PAGE, экстракцию растворителем и солью или прямое сбраживание белков in situ на поверхности НМ. С точки зрения метаболитов в короне, выделение является более сложным с различными методами с использованием растворителей или даже растворением НМ, предложенных в видерастворов 8,10,11. Однако, в отличие от белковой короны, подход «один размер подходит всем» вряд ли применим к выделению метаболитов из НМ из-за широкого химического пространства, занимаемого метаболомом, и разнообразия возможных НМ. Альтернативный подход заключается в характеристике биологической матрицы до и после воздействия НМ с разницей в концентрациях метаболитов, приписываемой адсорбции метаболитов к НМ.12
Этот альтернативный подход был бы применим ко всем биожидям и НМ, и, хотя он требует в два раза больше анализа, он, следовательно, предлагает гораздо более точную меру короны метаболита и не имеет риска низкого извлечения метаболитов с поверхности НМ, ошибочно принимаемого за низкое связывание конкретного метаболита.
Вторым шагом к анализу биомолекулярной короны является обнаружение биомолекул. Традиционно для белков в короне это было компетенцией нано-LC-MS, рабочей лошадки протеомики; также применялись другие подходы, такие как NMR13,1D и 2D SDS-PAGE. В терминах метаболита короны LC-MS7,GC-MS8 и прямой инфузионной масс-спектрометрии были использованы14. Тем не менее, новый подход в последнее время начал набирать обороты, а именно капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия (CE-MS)11,15 и присутствовал в лабораториях NM в качестве автономного метода для характеристики различных физических и химических свойств НМ16. CE-MS является методом ортогонального разделения наноLC-MS и GC-MS и способен позволять обнаруживать высокополярные и заряженные метаболиты17,18. Кроме того, CE-MS хорошо подходит для анализа белков и их посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование и гликозилирование19,20,21,22. Заключительный этап, идентификация и анализ данных, могут быть выполнены несколькими способами в зависимости от того, используется ли количественный / качественный или целевой / нецелевой подход, что, однако, выходит за рамки компетенции этого протокола.
CESI-MS, комбинация CE и интерфейса nanoESI, является недавним достижением в технологии CE с использованием интерфейса без оболочки. Это позволяет напрямую подключать сверхнизкий расход CE (<20 нл/мин) к масс-спектрометру высокого разрешения без разбавления, что приводит к значительному улучшению чувствительности обнаружения23,24,25. CESI-MS позволяет анализировать образцы с ограниченным объемом (< 10 мкл) при сохранении высокочувствительного анализа26. CESI-MS также выгодно отличается от традиционных подходов nanoLC-MS с низкой скоростью потока, используемых в протеомике и метаболомике с точки зрения воспроизводимости27,28,пропускной способности и переноса, что делает его захватывающей перспективой для полной характеристики биомолекулярной короны.
Чтобы подчеркнуть потенциал CESI-MS для анализа био-нано взаимодействий, в этой работе описывается пробоподготовка, необходимая для выделения биомолекулярной короны NM из одного образца плазмы человека таким образом, чтобы максимизировать данные как белкового, так и метаболитового аспектов полной биомолекулярной КОРОНЫ NM. Хотя мы сообщаем об использовании плазмы человека, этот протокол будет в равной степени подходит для других биожидкости, таких как сыворотка крови, полная клеточная культуральная среда, клеточный лизат, спинномозговая жидкость или моча. Анализ этих двух компонентов (белков и метаболитов) затем будет описан с использованием капилляров CESI с нейтральным покрытием для белковой короны и голых плавленых капилляров кремнезема для катионных и анионных метаболитов.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

Адсорбция биомолекул из окружающих биологических матриц на поверхность наноматериалов (НМ) для формирования короны представляет интерес в течение последнего десятилетия. Интерес к био-наноинтерфейсу возникает из-за того, что биомолекулярная корона придает биологическую идентичность НМ и, таким образом, заставляет организм идентифицировать их как «себя». Например, предыдущие исследования продемонстрировали, что белки в короне способны взаимодействовать с мембранными рецепторами, чтобы влиять на поглощение клеток, и установили, что корона ответственна за клеточный оборот НМ и их возможную токсичность. На сегодняшний день большинство исследований были сосредоточены на белковой короне и упускали из виду возможное воздействие метаболитов, включенных в корону, или синергетические эффекты между компонентами в полной биомолекулярной короне. Таким образом, эта работа демонстрирует методологии для характеристики как белковых, так и метаболитных компонентов биомолекулярной короны с использованием параллельно восходящей протеомики и метаболомики. Это включает в себя переваривание белковой короны на частицах с поверхностно-активным веществом, используемым для увеличения восстановления белка, и пассивную характеристику короны метаболита путем анализа матриц метаболитов до и после воздействия НМ. Эта работа вводит капиллярный электрофорез – масс-спектрометрию (CESI-MS) как новую технику для характеристики короны NM. Протоколы, описанные здесь, демонстрируют, как CESI-MS может быть использован для надежной характеристики как белка, так и метаболитовой короны, приобретенной НМ. Переход на CESI-MS значительно уменьшает объем требуемого образца (по сравнению с традиционными подходами жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (LC-MS)) с возможностью многократных инъекций всего из 5 мкл образца, что делает его идеальным для образцов с ограниченным объемом. Кроме того, экологические последствия анализа снижаются в отношении LC-MS из-за низких скоростей потока (<20 нл/мин) в CESI-MS и использования водных электролитов, что устраняет необходимость в органических растворителях.

Описанный способ является первым, который характеризует как белки, так и метаболиты в биомолекулярной короне NM с использованием одного и того же образца плазмы человека. Этот метод способен обнаруживать белки >200 и метаболиты >150, что позволяет определить наиболее полный обзор полной биомолекулярной короны, что позволяет лучше понять клеточное присоединение, поглощение и воздействие НМ.
Использование CESI-MS как для протеомики(Рисунок 1),так и для метаболомики(Рисунок 2)разделения и обнаружения показывает хорошие окна разделения на обоих капиллярах для каждого подхода.
Этот метод способен различать белки в короне в широком диапазоне НМ композиций, демонстрируя тем самым применимость способов к НМ в широком диапазоне физических и химических характеристик(таблица 1).
Уникальные отпечатки метаболита короны также можно различить с помощью метаболомной ветви этой методологии(рисунок 3). Хотя этот подход использует пассивный подход для характеристики короны метаболита NM, он все же способен раскрыть интересные идеи о роли метаболитов в биомолекулярной короне, такие как дифференциальная адсорбция изомеров(рисунок 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Рисунок 1: Примерная электроферограмма разделения короны белка SiO2 с использованием CESI-MS после дайджеста на частицах. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Рисунок 2: Пример экстрагированных ионных электроферограмм, полученных из эндогенных соединений в плазме методом CE-MS. Пронумерованные соединения следующие: 1. Орнитин; 2. Лизин; 3. Аргинин; 4. Гистидин; 5. Креатин; 6. Глицин; 7. Аланин; 8. Валин; 9. Изолейцин; 10. Лейцин; 11. Серин; 12. Треонин; 13. Аспарагин; 14. Метионин; 15. Глютамин; 16. Глутаминовая кислота; 17. Фенил-D5-аланин; 18. Фенилаланин; 19. Тирозин; 20. Пролин; 21. Метионинсульфон (внутренний стандарт). Опубликовано под лицензией Creative Commons CC BY в открытом доступе и воспроизведено из Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Анализ белковой короны в массиве из 6 НМ. Тепловая карта классов белков, идентифицированных на кремнеземе (SiO2),титании (TiO2),PVP-капсированной титании (TiO2-PVP), диспексной крышке титана (TiO2-Dispex), полистироле и карбоксилированном полистироле НМ. Проценты относятся к обилию белков относительно общего содержания белка на основе обилия пептидов верхнего 3 для каждого белка. Учитывая различия, наблюдаемые в относительном изобилии белков в различных NM коронах, ясно, что этот предлагаемый протокол достаточно чувствителен, чтобы различать белковую корону различных НМ. Рисунок воспроизведен из анализа CESI-MS белковой короны, опубликованного под открытым доступом Creative Commons CC BY лицензией11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Рисунок 3: Целевой анализ катионных метаболитов в NM короне. Адсорбция катионов к SiO2 и TiO2 НМ. Красный относится к начальной концентрации метаболитов, тогда как синий относится к концентрации метаболитов после инкубации 1 ч с НМ при 37 °C. Снижение концентрации метаболита в растворе является результатом адсорбции метаболита к поверхности НМ. Для НМ полистирола не наблюдалось значимой адсорбции метаболитов. Квадратные графики представляют минимальные и максимальные значения, медианный и межквартильный диапазоны. Рисунок, воспроизведенный из целевого анализа CESI-MS метаболита короны, опубликованного под открытым доступом Creative Commons CC BY лицензии15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Рисунок 4: Целевой анализ анионных метаболитов в короне НМ с акцентом на адсорбцию изомеров. Адсорбция ангонов к ряду НМ титанов показывает четкие различия между различными изомерами, такими как сахарные фосфаты. Красный цвет относится к начальной концентрации метаболитов, тогда как синий относится к концентрации метаболитов после инкубации 1 ч с НМ при 37 °C. Снижение концентрации метаболита в растворе является результатом адсорбции метаболита к поверхности НМ. Для SiO2 и полистироловых НМ не наблюдалось значимой адсорбции метаболитов. Квадратные графики представляют минимальные и максимальные значения, медианный и межквартильный диапазоны. Рисунок, воспроизведенный из целевого анализа cesi-MS метаболита короны, опубликованного под лицензией Открытого доступа Creative Common CC BY15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Аналит</td>
			<td>Средняя пиковая площадь RSD</td>
			<td>Среднее время миграции RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 пептидов внутри дня (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 катионов в течение дня (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 катион междневных (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Воспроизводимость технических реплик CESI-MS для пептидов и катионных метаболитов. RSD: относительное стандартное отклонение, как мера воспроизводимости. Воспроизводимость CESI-MS с точки зрения пиковых районов и времени миграции очень хорошая, при этом все анализируемые имеют средний RSD <15%, а время миграции <2,2%. Эти результаты демонстрируют высокую степень достоверности, которую можно отнести к данным, собранным с использованием этого метода, и подтверждают, что обнаруженные вариации обусловлены подлинными различиями в составе образца (обогащение на НМ), а не аналитическими вариациями. Таблица 2 получена на ранее представленныхрезультатах 11,15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Здесь представлен протокол для характеристики полной биомолекулярной короны, белков и метаболитов, приобретенных наноматериалами из биожидких с использованием подхода капиллярного электрофореза – масс-спектрометрии.

Подходы масс-спектрометрии капиллярного электрофореза для характеристики белковой и метаболитовой короны, приобретенной наноматериалами

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K Views.  University of Birmingham. Здесь представлен протокол для характеристики полной биомолекулярной короны, белков и метаболитов, приобретенных наноматериалами из биожидких с использованием подхода капиллярного электрофореза – масс-спектрометрии.

Video: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Biochemistry

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Извлечение aqueous Метаболитов из культовых клеток присоединения для метаболомического анализа капиллярной электрофорез-масс-спектрометрии

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Cancer Research

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Крупномасштабные протеомики сверху вниз с использованием зоне капиллярного электрофореза тандем масс-спектрометрия

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Анализ Большие белковые комплексы структурных масс-спектрометрии

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biology

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

Т-волны ионной подвижности-масс-спектрометрии: Основные экспериментальные процедуры для комплексного анализа белков

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Профилирование метилтрансферазы и других S-Аденозил- L-Гомоцистеин-связывающих белков Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе<sup&gt; 15</sup&gt; N Метаболический маркировки, Иммунопреципитация, Количественный масс-спектрометрии и Affinity модуляции

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Открывая белковых взаимодействий и Характеризуя Protein функций с помощью HaloTag технологии

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Подходы масс-спектрометрии капиллярного электрофореза для характеристики белковой и метаболитовой короны, приобретенной наноматериалами

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST