Общей целью этой процедуры является подготовка здоровых острых ломтиков спинной промежуточной области гиппокампа для длительных записей и реконструкции нейронов у взрослых мышей. Многие лаборатории, как наша, изучение спинного гиппокампа за его роль в специальном обучении и навигации. Общие методы, используемые для этой цели являются поведенческие эксперименты, анатомические трассировки, и региональные конкретные манипуляции.
Мы разработали метод нарезки мозга, чтобы объединить электрофизиологию с этой техникой, чтобы обеспечить прямую корреляцию invivodata в видеозаписях. Преимущество этого протокола заключается в том, что он сочетает в себе простую процедуру получения поперечных срезов с использованием защитного раствора для повышения жизнеспособности тканей мозга. Этот подход особенно подходит, когда зрелые животные используются как в поведенческих экспериментах.
Чтобы начать эту процедуру, подготовь рядом с раковиной необходимое оборудование для этого раздела. Приготовьте на льду стакан 150 миллилитров и две стеклянные чашки Петри диаметром 10 сантиметров каждая. Нарисуйте три части линий до нижней части пластиковой чашки Петри и распоите эту тарелку близко к ледяному подносу.
Вам также понадобится клей и держатель образца для вибромы. Затем оснастить хирургическое скамейку большими ножницами, маленькими ножницами, закругленным кончиком пинцета, тонкой кончиком пинцета, тонким металлическим шпателем, большим металлическим шпателем и переносным пипеткой. Очистите блюда Петри с режущей раствором.
Одно блюдо для выполнения вскрытия головы, а другое для вскрытия мозга. В последнем также поместите лист фильтровальной бумаги. Также заполните стакан с 30 миллилитров резки раствора.
Это будет необходимо для перфузии транскардиального. Заполните вибром лоток с ледяной резки раствора и сохранить все решения кислородом с карбогеном восходящей устройства. Добавьте измельченный лед из замороженной партии режущей раствора в холодный свежий раствор для резки, чтобы снизить температуру.
Обратите внимание, чтобы держать лед от лезвия во время нарезки. Почти все шаги после на душу населения выполняются в рамках решений. Это помогает сать метаболизм кислорода лишения до минимума.
Подготовь инкубационный зал, наполненный режущей раствором при постоянной оксигенации. Поместите камеру в предварительно разогретую водяную баню при 35 градусах Цельсия. Подготовьте камеру хранения ломтика с несколькими независимыми скважинами и заполните ее раствором для хранения.
Держите его под постоянной оксигенацией при комнатной температуре. В случае, если ткань выражает флуоресцентный белок или легкий активированный опсонин. Рекомендуется держать камеру в темноте.
Например, внутри коробки. После выполнения перфузии транскардиального, поместите голову мыши в чашку Петри с ледяным раствором резки. Откройте кожу мелкими ножницами, чтобы разоблачить череп.
Начиная с foramen magnum, вырезать вдоль sagittal шва до достижения насофронтальный шов. Будьте осторожны, чтобы слегка подтянуть ножницы, чтобы избежать повреждения мозга. Сделайте два бокового разреза в основание черепа.
Используйте закругленный кончик пинцета, чтобы подтянуть теменные кости. Будьте осторожны, чтобы также удалить околивания. Если оставить они могут повредить мозг во время извлечения.
Используйте небольшой шпатель, чтобы мягко ослабить мозг от основания черепа. С помощью небольшого шпателя отсоедините мозг от черепных нервов и перенесите мозг на небольшой кусочек фильтровальной бумаги во второй чашке Петри. Разрежьте мозг пополам вдоль продольной трещины с помощью предварительно охлажденного лезвия.
Разделите два полушария, используя самый маленький шпатель. Используйте самый большой шпатель, чтобы перенести одно полушарие в пластиковую чашку Петри с ее медиальной поверхностью лицом вниз. Выровнять теменной коры с одной из параллельных линий, чтобы иметь ссылку на второй разрез.
Используйте лист фильтровальной бумаги, чтобы высушить избыток раствора. Распорежьте лезвие параллельно линиям и разрежьте вентраловую часть полушария. Эта плоская поверхность будет позже приклеена к держателю образца.
Верните полушарие в кислородный хлопчатобумажный раствор стеклянной чашки Петри и выполните ту же процедуру на втором полушарии. Поместите каплю цианоакрилатного клея на держатель образца вибромы и распределите его шпателем, чтобы создать тонкий слой. Перенесите полушарие на держатель вибромы с брюшной стороной вниз, используя округлую сторону шпателя.
Начиная эту нарезку из теменной коры сократит время, необходимое для сбора спинной области гиппокампа. Добавьте несколько капель холодного раствора для затвердения клея. Переместите держатель образца в поднос с вибромой и при соответствующих настройках нарежьте мозг до тех пор, пока не будет видна область спинного гиппокампа.
Затем соберите ломтики с помощью пластиковой трубы передачи. Перенесите каждый кусочек в инкубационую камеру и дайте ему отдохнуть в течение 12 минут. В то же время, приступить к сокращению следующих ломтиков.
После 12 минут инкубации перенесите ломтики в камеру хранения. И дайте ему отдохнуть до начала эксперимента. Чтобы продемонстрировать чистоту нашего препарата, мы сравниваем его с корональным препаратом, который обычно используется для записи из спинного гиппокампа.
Здесь показаны дифференциальные интерференционные контрастные микрографы, приобретенные из верхнего лезвия зубной извилины острыми ломтиками у двухмесячных мышей. В поперечном срезе нейроны в основном показывали гладкие поверхности и только вероятные контрастные границы, обозначенные черными стрелками. Нейроны в coronal ломтиками однако часто появлялись курс и показали сильно контрастные очертания, указанные белыми стрелками.
Это говорит о лучшей жизнеспособности нейронов в поперечном срезе. В соответствии с этим впечатлением, среднее время, чтобы запечатать образование во время исправления в наших поперечных ломтиков было значительно быстрее, чем в корональных ломтиков. Как общий прокси для целостности клеток, мы записываем, что упокоения мембранных потенциалов гранул клеток и парвалбумин положительные интер нейроны, которые, где значительно больше деполяризировать в обоих типах клеток в корональных по сравнению с поперечных ломтиков.
Что в конечном итоге привело к значительно больше клеток, которые должны были быть исключены в корональной подготовки. По мере того как аксоны гранулы клетки бегут в поперечной плоскости, реконструкция записанных клеток привела к извлечению вполне axonal arborization в нашей подготовке. Это было не так в корональных ломтиков, где аксоны, возможно, легко были разорваны.
Кроме того, морфологическая реконструкция парвалбумина положительные межвальные нейроны в поперечных ломтиков позволило изображение обширной аксональной и дендритической беседки, в том числе визуализации мелких деталей, таких как дендритные шипы. В целом, мы представили методы нарезки для получения поперечных ломтиков гиппокампа с высокой нейрональной жизнеспособности для взрослых мышей. Этот метод может быть использован для измерения электрофизиологических исследований in vitro с анатомических и поведенческих исследований упором на промежуточной спинной части гиппокампа.
