El objetivo general de este procedimiento es preparar rodajas agudas saludables de la región intermedia dorsal del hipocampo para grabaciones a largo plazo y reconstrucción de neuronas en ratones adultos. Muchos laboratorios como el nuestro, estudiando hipocampo dorsal por su papel en el aprendizaje especial y la navegación. Las técnicas comunes empleadas para este propósito son experimentos conductuales, seguimiento anatómico y manipulaciones específicas regionales.
Hemos desarrollado un método de corte cerebral para combinar la electrofisiología con estas técnicas para permitir la correlación directa de los invivodata dentro de las grabaciones de vídeo. La ventaja de este protocolo es que combina un procedimiento sencillo para obtener rodajas transversales con el uso de la solución protectora para mejorar la viabilidad del tejido cerebral. Este enfoque es particularmente adecuado cuando los animales maduros se utilizan como en experimentos conductuales.
Para comenzar este procedimiento, prepare junto al fregadero el equipo necesario para esta sección. Prepare en hielo un vaso de precipitados de 150 mililitros y dos placas de cristal Petri de 10 centímetros de diámetro cada una. Dibuje tres partes de las líneas hasta la parte inferior de una placa de plástico Petri y coloque este plato cerca de la bandeja de hielo.
También necesitará pegamento y el soporte de la muestra para el vibratome. A continuación, equipe el banco de cirugía con grandes tijeras, pequeñas tijeras, pinzas de punta redondeadas, pinzas de punta fina, una espátula de metal delgada, una espátula de metal grande y pipetas de transferencia. Pelar las placas De Petri con una solución de corte.
Un plato para realizar la disección de la cabeza y el otro para la disección del cerebro. En este último, coloque también un trozo de papel filtrante. También llene el vaso de precipitados con solución de corte de 30 mililitros.
Esto será necesario para la perfusión transcardial. Llene la bandeja de vibratome con solución de corte en frío y mantenga toda la solución oxigenada con un dispositivo burbujeante de carbógeno. Agregue el hielo triturado hecho del lote congelado de solución de corte a la solución de corte fresco en frío para mantener la temperatura baja.
Presta atención, para mantener el hielo de la hoja mientras cortas. Casi todos los pasos después de la capitanía se realizan dentro de las soluciones. Esto ayuda a mantener la privación de oxígeno del metabolismo al mínimo.
Prepare una cámara de incubación llena de una solución de corte bajo oxigenación constante. Coloque la cámara en un baño de agua pre-calentado a 35 grados Celsius. Prepare una cámara de almacenamiento en rodajas con varios pozos independientes y llénelo con solución de almacenamiento.
Manténgalo bajo oxigenación constante a temperatura ambiente. En caso de que el tejido exprese una proteína fluorescente o una opsonina activada por luz. Es recomendable mantener la cámara en la oscuridad.
Por ejemplo, dentro de la caja. Después de realizar perfusión transcardial, coloque la cabeza del ratón en la placa De Petri con la solución de corte en frío de hielo. Abre la piel con unas tijeras finas para exponer el cráneo.
Comenzando en el foramen magnum, cortar a lo largo de la sutura sagital hasta llegar a la sutura nasofrontal. Tenga cuidado de levantar ligeramente las tijeras para evitar el daño del cerebro. Haga dos incisiones laterales en la base del cráneo.
Usa las pinzas redondeadas para levantar los huesos parietales. Tenga cuidado de también eliminar las meninges. Si se quedan pueden dañar el cerebro durante la extracción.
Usa la pequeña espátula para aflojar suavemente el cerebro de la base del cráneo. Con una pequeña espátula, separa el cerebro de los nervios craneales y transfiere el cerebro a un pequeño pedazo de papel filtrante en la segunda placa De Petri. Corta el cerebro en mitades a lo largo de la fisura longitudinal usando una hoja pre-enfriada.
Separe los dos hemisferios usando la espátula más pequeña. Utilice la espátula más grande para transferir un hemisferio a la placa de plástico Petri con su superficie medial hacia abajo. Alinee la corteza parietal con una de las líneas paralelas para tener una referencia para el segundo corte.
Utilice un trozo de papel filtrante para secar el exceso de solución. Coloque la hoja en paralelo a las líneas y corte la parte ventral del hemisferio. Esta superficie plana se pegará posteriormente en el soporte de la muestra.
Vuelva al hemisferio en la solución de algodón oxigenado de la placa de cristal Petri y realice el mismo procedimiento en el segundo hemisferio. Coloque una gota de pegamento de cianoacrilato en el soporte de la muestra de vibratome y esparce con una espátula para crear una capa delgada. Transfiera el hemisferio sobre el soporte de vibratome con el lado ventral hacia abajo utilizando el lado redondeado de la espátula.
Comenzar este corte desde la corteza parietal reduciría el tiempo necesario para recoger la región dorsal del hipocampo. Añadir unas gotas de solución de corte en frío para solidificar el pegamento. Mueva el soporte de la muestra a la bandeja de vibratome y, con los ajustes adecuados, corte el cerebro hasta que la región del hipocampo dorsal sea visible.
A continuación, recoger las rodajas con el uso de una pipeta de transferencia de plástico. Transfiera cada rebanada a la cámara de incubación y déjela reposar durante 12 minutos. Mientras tanto, proceda con el corte de las siguientes rebanadas.
Después de los 12 minutos de incubación, transfiera las rodajas a la cámara de almacenamiento. Y deja que descanse hasta el comienzo del experimento. Para demostrar la pureza de nuestra preparación, la comparamos con una preparación coronal que se utiliza comúnmente para registrar desde el hipocampo dorsal.
Aquí se muestra, micrografía de contraste de interferencia diferencial adquirida de la hoja superior del giro desntario en rodajas agudas de ratones de dos meses de edad. En la rebanada transversal, las neuronas mostraban principalmente superficies lisas y sólo bordes contrastados probables, indicados por flechas negras. Las neuronas en rodajas coronales, sin embargo, a menudo aparecían por supuesto y mostraban contornos fuertemente contrastados, indicados por flechas blancas.
Esto sugiere una mejor viabilidad de las neuronas en la rebanada transversal. De acuerdo con esta impresión, el tiempo promedio para sellar la formación durante el parcheo en nuestras rodajas transversales fue significativamente más rápido que en las rodajas coronales. Como un proxy general para la integridad celular, registramos que los potenciales de membrana en reposo de las células del gránulo y parvalbumin positiva inter neuronas que donde significativamente más despolarizar en ambos tipos de células en rodajas coronales versus transversales.
Lo que al final resultó en significativamente más células que tuvieron que ser excluidas en la preparación coronal. A medida que los axones de células de gránulo corren en el plano transversal, la reconstrucción de las células registradas resultó en la recuperación de la arborización axonal completa en nuestra preparación. Este no fue el caso en rodajas coronales donde los axones pueden haber sido fácilmente cortados.
Además, la reconstrucción morfológica de las inter neuronas parvalbumina positivas en rodajas transversales permitió la representación de una amplia arborización axonal y dendrítica, incluyendo la visualización de pequeños detalles, como espinas dendríticas. Sobre todo, hemos presentado un método de corte para obtener rebanadas transversales de hipocampo con alta viabilidad neuronal para ratones adultos. Este método se puede utilizar para medir la investigación electrofisiológica in vitro con estudios anatómicos y conductuales centrados en la parte dorsal intermedia del hipocampo.
