Привет всем. Меня зовут Николя Вейн. Я главный исследователь в Национальной детской больнице в Колумбусе, штат Огайо.
И сегодня мы покажем вам видео о том, как сделать биопсию кожи и преобразовать ее в миобласты и миотрубы. Это очень полезный инструмент для изучения нервно-мышечного расстройства. Кроме того, это способ быстрее технологии по сравнению с IPSC, потому что мы используем два различных типа вируса для непосредственной борьбы с этим типом клеток.
Это видео демонстрирует протокол для создания человеческой кожи производных фибробластов культур, преобразование в миобласты, а затем дифференцированные миотубы. Биопсия кожи передается клеточной культуре для получения кожных фибробластов. Лентивирусы, несущие гены hTERT и MYOD, используются для трансдукций этих фибробластов.
При добавлении среды роста миобласта, дополненной доксициклином, выражается ген MYOD, вызывающий преобразование фибробластов в миобласты. Далее среда переключается на дифференциацию среды, также дополняется доксициклиной. Затем миобласты сливаются друг с другом, образуя многоядерные миотрубы.
Аспирировать средства массовой информации из трубки и промыть биопсию с 10 миллилитров, один х PBS при комнатной температуре, в три раза. После третьей стирки оставьте PBS в трубке. Вылейте PBS и биопсии кожи на 10 сантиметров в квадрате блюдо.
Используя стерильные скальпели, разрежьте биопсию на кусочки, которые как можно меньше. Используя пипетки, перенесите отдельный кусок кожи на стерильную 10-сантиметровую тарелку в квадрате. Аспирировать избыток PBS со всего каждого куска.
Будьте осторожны, чтобы не аспирировать сам кусок. Накройте посуду крышкой частично и дайте части биопсии кожи высохнуть в течение пяти-20 минут. Не позволяйте части высохнуть слишком долго.
Как только кусочки высохнут, наклоните блюдо под углом 45 градусов и медленно добавьте 12 миллилитров фибробластовой среды в угол блюда. Опустите блюдо, тщательно распространяя средства массовой информации, чтобы части не поднимались в средствах массовой информации. Поместите посуду в инкубатор.
Замените средства массовой информации в течение пяти-семи дней, и один раз в неделю после этого. Семена первичных фибробластов на 30% слияния и две скважины из 12 пластины скважины, примерно 20000 клеток на скважину, для того, чтобы иметь около 50% слияния на следующий день. Для лентивирусной трансдукции добавьте от двух до 5 миллиардов вирусных геномов hTERP Puromycin Lentivirus и 400 микролитров фибробластовой среды.
Добавьте смесь лентивируса в один колодец. Во вторую колодец добавьте всего 400 микролитров фибробластовой среды. На следующий день добавьте один миллилитр мультимедиа.
Один или два дня спустя, передать клетки в шесть пластины хорошо и расти их до достижения 60 до 70% слияния. Дополните фибробластовую среду одним микрограммом на миллилитр пуромицина и добавьте по два миллилитров к каждому хорошо. Держите клетки под отбором до тех пор, пока все клетки в управлении хорошо мертвы, по крайней мере 12 дней, изменение средств массовой информации каждые два-три дня.
Диаграмма Seed H, выражаюющая фибробласты при слиянии 30% в трех скважинах из 12 скважин, на следующий день будет иметь около 50% слияния. Для лентивирусной трансдукции смешайте от двух до пяти миллиардов вирусных геномов MYOD Hygromycin B lentivirus и 400 микролитров фибробластовой среды и добавьте к двум скважинам. Добавьте один миллилитр среды на следующий день.
Через один-два дня перенесите клетки в шестиурочные пластины и расти до 60-70% стечения. Дополнение средств роста с 400 микрограммов на миллилитр hygromycin B.Add два миллилитров к каждой хорошо. Держите клетки под отбором до тех пор, пока все клетки в контрольных скважинах не умер, как правило, занимает по крайней мере 12 дней, меняя средства массовой информации каждые два-три дня.
Для индукции миобластов, растут фибробласты, пока они не 70%confluent. Добавьте восемь микрограмм на миллилитр доксициклина в миобластную среду роста. Всегда используйте свежие алициты доксициклина и среднего.
Среда должна быть подготовлена прямо перед любыми изменениями в средствах массовой информации. Кроме того, доксициклин не должен быть перепрофилен. Аспирировать фибробластовую среду и промыть клетки с помощью PBS.
Добавьте 10 миллилитров дополненных миобластных средств массовой информации. Два-три дня спустя, клетки от 90 до 95% стечения и их морфология будет изменена. Аспирировать myoblast роста средств массовой информации и промыть поверхность клетки с PBS.
Добавьте 10 миллилитров средств дифференциации, которые были дополнены восемью микрограммами на миллилитр свежего доксициклина. Продолжайте менять средства массовой информации каждые два-три дня, пока миотрубы не будут сформированы. Через семь-десять дней после начала дифференциации миотрубов клетки должны быть полностью дифференцированы, но это варьируется от одной клеточной линии к другой.
Первые фибробласты могут появиться через пять дней после того, как кусочки кожи были в культуре. На рисунке B фибробласты стечены и готовы к переводу на 75-сантиметровые квадратные колбы для дальнейшего распространения. Важно заморозить несколько флаконов фибробластов при низких количествах проходов, так как первичные клетки попадают в репликационую сенесценцию.
После того, как FM-клеточные линии установлены для преобразования фибробластов в миотрубы, фибробласты должны размножаться до 70% стечения, как показано на рисунке A.It важно не превышать 80% слияния, так как высокая плотность может нарушить дифференциацию. После добавления доксициклина к среде, в течение двух-четырех дней клетки становятся миобластами, характеризующимися удлиненной морфологией и параллельной ориентацией, как показано на рисунке B.Differentiated myotubes показаны на картинке C.The время для синтеза и дифференциации миотрубов может варьироваться от семи до 21 дней в зависимости от генотипа клеток. Ячейки должны быть собраны или исправлены, прежде чем они отсоединяются.
Начало отряда можно наблюдать по цвету и яркости краев миотруба, о чем указывают стрелки на этой картинке. По иммунофторесценции, выражение зрелых мышц конкретных белков подтверждает успешное преобразование фибробластов в миотрубы. На этих снимках показаны три разные клетки.
Степень дифференциации будет варьироваться от клетки к клетке, и может или не может быть вызвана первичной мутации, как это в случае клеток в цифрах B и C.Дальнейшее подтверждение модели было подтверждено RNAseq. Как показано на этом сюжете Есть более чем 12000 дифференцированно выраженных генов, обнаруженных в FM миотрубы по сравнению с скелетной мышцы. Значительная корреляция между обоими транскриптомами поддерживает то, что FM-клетки имеют профиль выражения мышц, демонстрирующий, что они полезны и надежны суррогат для мышечных клеточных линий.
Чтобы проиллюстрировать полезность этой модели in vitro, мы использовали одно из наиболее распространенных экзонических дублирований в гене DMD. Дублирование Exon 2 приводит к нарушению dmD читальный кадр, и его пропуск может привести либо к восстановлению, что чтение кадра или использования внутреннего рибосомы вступления сайта. Эта терапия уже была проверена с in vivo исследований Рисунок А, мы продемонстрировали доказательство концепции анализа RTPCR этой конкретной мутировавших клеточных линий, с и без лечения путем exon пропуска.
Западная помарка на рисунке B демонстрирует, что функциональный белок дистрофина выражается в обработанных клетках. Сравнивая эффективность этой терапии с моделями in vivo, результаты поддерживают надежность метода дифференциации клеток и поддерживают ее использование для тестирования различных мутаций специфических генных методов лечения. Перед клиническими исследованиями необходимо проверить эффективность официальной терапевтической поддержки на нервно-мышечные расстройства, в зависимости от способности животных и клеточных моделей.
Развитие моделей животных, хотя и легче в настоящее время, его не представляется возможным вариантом для каждой конкретной мутации. Поколение миобластов через IPS-клетки, полученные из кожных фибробластов является альтернативой, но это трудоемкий метод. Таким образом, эта процедура является простой альтернативой IPS поколения, что позволяет для прямого преобразования фибробластов в миобласты.
Это облегчает доступ к моделям клеток человека, избегая более инвазивного применения биопсии мышц В заключение, это прямое преобразование фибробластов в миобласты является мощным инструментом для тестирования терапии нервно-мышечных расстройств в ограничении конкретного контекста.
