Этот протокол, для которого все экспериментальные условия были тщательно оптимизированы, может быть использован для содействия успешной и эффективной химической конъюгации антитела DEC-205 к антигену OVA. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он позволяет гибко выбирать белковый антиген и антитело, и что он не полагается на генетическое слияние этих компонентов. Мы также использовали этот протокол для генерации конъюгатов белков вируса гепатита С и анти-DEC-205 для таргетирования in vivo DC.
Это также может быть полезно для подходов к противоопухолевой вакцинации. Чтобы начать производство анти-DEC-205, повторно суспендируйте объем в один миллилитр от одного до пяти миллионов размороженных крио-сохраненных клеток NLDC 145 в девяти миллилитрах среды 37 градусов Цельсия ISF-1, дополненной 1% пенициллина и стрептомицина, и посейте клетки в колбу для культуры клеток площадью 25 квадратных сантиметров для инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24-48 часов. Когда клетки достигнут 70% конической трубки, переместите всю клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров и соберите клетки путем центрифугирования.
Повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах свежей полной 37-градусной среды ISF-1 и повторно обложите ячейки в колбу площадью 75 квадратных сантиметров. После 48-72 часов культивирования разделите 70% сливающуюся культуру между каждой из двух новых колб площадью 75 квадратных сантиметров и добавьте шесть миллилитров свежей полной среды ISF-1 в каждую колбу. Когда культуры достигнут 70% сливания, используйте 10-миллилитровую пипетку для промывки дна колбы клеточной культуры и поверхностей культуры клеточной суспензией, чтобы собрать все клетки и перенести 10 миллилитров каждой расширенной клеточной суспензии NLDC 145 в отдельные роликовые бутылки PETG.
Затем добавьте 140 миллилитров полной среды ISF-1 к каждой культуре роликовой бутылки и культивируйте роликовые бутылки при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа и 25 раундов в минуту в течение трех дней. Для очистки антител от супернатанта NLDC 145 поместите конец кремниевой трубки в заполненный супернатантом стакан и позвольте 800 миллилитрам супернатанта пройти по каплям через столбец белка G Sepharose. Для элюирования добавьте 100 микролитров 1,5 моляра Tris-HCL в каждую из двадцати 1,5 миллилитровых трубок и снимите резиновую заглушку из колонки.
Переложите один миллилитр 0,1 молярного глицина в верхнюю камеру колонны и соберите антитело, содержащее элюент, в одну из подготовленных 1,5 миллилитровых пробирок и повторите для каждой пробирки. Когда все антитела собраны и элюированные антитела будут объединены, закройте дно диализной трубки длиной 20 сантиметров соответствующим закрытием диализной трубки и осторожно вставьте элюирование антител в трубку. Закройте верхнюю часть диализной трубки вторым зажимом и закрепите верхний зажим диализной трубки на плавающей подставке.
Добавьте магнитный перемешиватель в стакан PBS и поместите его на магнитную мешалку. После ночного диализа при четырех градусах Цельсия откройте один зажим, чтобы обеспечить загрузку полного диализата в центробежный концентратор с отсечкой молекулярной массы 10 килоДальтона, и центрифугируйте концентратор в течение 30 минут при 693 раза g и четырех градусах Цельсия. В конце спина нагружают центробежный концентратор 10 миллилитрами ПБС для второго центрифугирования до получения окончательного объема раствора антител до 1,5 миллилитра.
Чтобы конъюгировать OVA с антителом против DEC-205, добавьте 200 микролитров PBS, дополненных 500 микрограммами белка OVA, 240 микролитрами свежеприготовленного раствора TCEP-HCL и 560 микролитрами стерильной сверхчистой воды в 1,5 миллилитровую трубку для 1,5-часовой инкубации при комнатной температуре. В то же время добавьте 2,5 миллиграмма анти-DEC-205 в 900 микролитрах PBS и 100 микролитров свежеприготовленного сульфо-SMCC во вторую 1,5-миллилитровую трубку для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия при 550 оборотах в минуту в нагревательном блоке. В конце инкубации поместите обессолительные колонны с ослабленными колпачками и скрученными днами в отдельные 15-миллилитровые конические трубки и центрифугируйте колонны для удаления жидкости.
После центрифугирования поместите колонны в новые трубки со снятыми колпачками и медленно загрузите растворы антител сульфо-SMCC и OVA TCEP-HCL в центр компактного смоляного слоя по одной колонке на раствор. После центрифугирования отбросьте колонки и сразу же смешайте растворы антител и OVA с мягким пипетированием. Загрузите раствор anti-DEC-205/OVA на концентратор центробежного белка и заполните концентратор PBS до объема 15 миллилитров.
Центрифугируйте концентратор в течение пяти минут при 2000 G и комнатной температуре и заполните концентратор дополнительными 10 миллилитрами PBS. После центрифугирования концентрации в течение не менее восьми минут в тех же условиях центрифуги осторожно соберите концентрированный образец из верхней камеры. Чтобы проверить успешность конъюгации с помощью анализа вестерн-блотт, загрузите аликвоту из каждого образца на стандарте белка на гель SDS и запустите гель в соответствии со стандартными протоколами анализа SDS-PAGE.
После гелевого промокания окрашивают мембраны конъюгированными антителами пероксидазы хрена для обнаружения анти-DEC-205 или OVA в соответствии со стандартными протоколами. Затем мембраны могут быть проанализированы на наличие соответствующего белка в каждом образце. Чтобы проверить успешность конъюгации с помощью ИФА, покройте соответствующую 96-луночную ИФА-пластину 100 микролитрами анти-OVA антитела на лунку и последовательно разбавляйте анти-DEC-205/OVA в соотношении один к двум и блокирующим буфером для получения разбавлений от шести микрограммов на миллилитр до 93,8 нанограмм на миллилитр.
Добавляют 100 микролитров каждого разведения в соответствующие лунки пластины, покрытой антителами, для одночасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавляют 100 микролитров конъюгированного антитела пероксидазы хрена против конъюгата анти-DEC-205/OVA на пластину для часовой инкубации при комнатной температуре, затем добавляют 50 микролитров субстрата пероксидазы хрена в каждую лунку, чтобы обеспечить анализ цветовой реакции с помощью спектрофотометрии. Параллельный вестерн-блот-анализ может быть использован для обнаружения как сопряженной OVA, так и сопряженной анти-DEC-205.
Окрашивание для OVA позволит обнаружить избыток свободной OVA, если она присутствует, а окрашивание для анти-DEC-205 подтверждает успех конъюгации за счет увеличения молекулярной массы между голым анти-DEC-205 и конъюгатом. ИФА также может быть использована для оценки успешности конъюгации с положительной связью между обнаруженным сигналом и анализируемым количеством белка, что указывает на успешную генерацию конъюганта анти-DEC-205/OVA. Анализ проточной цитометрии и иммунофлуоресценции ясно показывают, что ядро анти-DEC-205 эффективно связывает CD11c-положительные клетки, полученные из костного мозга.
Вакцинация анти-DEC-205/OVA в сочетании с адъювантом вызывает увеличение OVA-специфических титров IgG у мышей-реципиентов по сравнению с вакцинацией OVA и только адъювантом. Кроме того, анти-DEC-205/OVA эффективно индуцирует сверхспецифические CD4 и CD8-положительные Т-клеточные ответы с анти-DEC-205/OVA-индуцированными CD8-положительными Т-клетками, значительно превышающими те, которые индуцируются только OVA. Для успешной конъюгации антигена OVA с антителом против DEC-205 важно подготовить материалы, как показано, и выполнить этапы конъюгации в последовательных условиях.
После успешной конъюгации антигена и антитела возможны многочисленные последующие подходы, включая связывающий анализ и индукцию патогенного или опухолевого иммунитета in vivo.
