Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как, как белые кровяные тельца активированы, и как аллергия на отдельные аллергены развиваться? Основным преимуществом этой надежной и воспроизводимой модели мыши аллергии является то, что меньше мышей могут быть использованы для того, чтобы дать более низкую дисперсию с экспериментальной популяцией. Новые иммунотерапии для контроля иммунных реакций требуют надежных моделей мыши в качестве первоначального средства тестирования эффективности in vivo.
Таким образом, последствия этого метода распространяются на иммунотерапию аллергии. Хотя этот метод может обеспечить понимание аллергии, он также может быть применен к другим системам, таким как аутоиммунные заболевания, в которых нежелательные реакции антител играют ключевую роль в болезни. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за отсутствия опыта работы с липосомных наночастиц или неопытность с методами, необходимыми в работе мыши.
Начните с добавления 2,5 молярного эквивалента гетеробифункционального кросслинкера к белку и размещения реакции на колеблющийся шейкер при комнатной температуре в течение примерно одного часа. После часовой инкубации с ПОМОЩЬю SPDP, desalt белка на колонке equilibrated в 100-миллимолярный ацетат натрия, и собирать фракции. Определите абсорбанс 280 нанометров и объединить верхние фракции.
Вымойте столбец в PBS, и добавить 25-миллимолярный дитиотрейтол, или DTT, в объединились фракции белка в течение пяти до 10 минут инкубации. Затем измерьте 280 и 343-нанометровые абсорбансы белка, чтобы обеспечить расчет коэффициента связи на основе молярности белка и связующих звена. Затем запустите слились фракции промытой PBS колонны и соберите фракции для измерения 280-нанометрового и верхнего фракций, как это было продемонстрировано.
Добавьте соответствующий объем 100x DSPE-PEG2000-Maleimide к белку для достижения 1x, 10-кратной превышения конечной концентрации моляра с нежным закрученным. Затем запустите реакцию на ночь под азотом в запечатанной колбе с круглым дном. На следующий день запустите белок над перекрестным столбом шарика геля декстрана, и храните окончательные соединенные фракции липид-связанного протеина на 4 градусах Celsius до их пользы.
После того, как правильное количество каждого липида была рассчитана, объединить все липиды в 12-миллилитровый борозиликат стеклянной пробирке, и использовать три миллилитров шприца и трубки, чтобы тщательно взорвать хлороформ с азотом. Затем, лиофилизировать раствор с 100 микролитров DMSO в одночасье. На следующее утро добавьте один миллилитр липидного белка в 12-миллилитровую липидную трубку и проясните раствор три-четыре раза в течение 30-60 секунд на звуковой водяной бане с не менее чем пятиминутным отдыхом между звуковыми данными.
После последней звуковой нагрузки загрузите образец в один из экструдивных шприцев, помещенных в экструдер, и поместите экструдерный шприц на другой конец экструдера. Пустой шприц будет заполняться, как липид экструдирован через поликарбонат 0,8-микрометровой мембраны. Поместите полностью собранный экструдер в нагревательный блок и аккуратно угнетайте поршень, чтобы опорожнить шприц.
После последнего экструзии перенесите липосомы в чистый флакон и выдавите липиды через поликарбонатные 0,2 и 0,1-микрометровые мембраны, как это было продемонстрировано. Затем храните липосомы при четырех градусах по Цельсию. Чтобы контролировать реакцию B-клеток на антигенную липосомную активацию, повторно потекуте 1,5 раза 10 к седьмым спеноцитам в буфере загрузки потока кальция, и добавьте 1,5-микромолярную Индо-1 к клеткам, несколько раз инвертатив раствор в трубке для смешивания.
После 30-минутной инкубации водяной ванны при 37 градусах Цельсия, защищенных от света, добавьте в пять раз больше буфера нагрузки потока кальция и центрифугайте индо-1-маркированные клетки. Для B-клеточного гэтинга, пятна клеток с анти-CD5 и анти-B220 антитела в 0,5 миллилитров погрузочного буфера при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут, защищены от света. В конце инкубации, мыть клетки в свежем буфере потока кальция загрузки, и повторно гранулы в один-два раза от 10 до седьмой клетки на миллилитр свежего потока кальция работает буфер для хранения на льду, защищены от света до анализа.
Затем добавьте 0,5 миллилитров клеток в ограниченную пятими миллилитровую, круглую нижнюю, полистироловую трубку и согрейте клетки до 37 градусов по Цельсию на водяной бане. Через три-пять минут перенесите трубку в 37-градусную камеру с водяными куртками по Цельсию, подключенную к рециркацивной водяной бане, и запустите трубку в водяной куртке на цитометре потока. Собрав от 5 000 до 10 000 событий в секунду, позвольте ячейкам стабилизироваться в течение 15-30 секунд и восстановить сбор данных, собирая данные в течение по крайней мере 10 секунд, чтобы установить фоновое чтение.
На 10-секундной отметке быстро удалите трубку из цитометра потока и добавьте соответствующую экспериментальную концентрацию антигенных липосом. Затем пульс вихрем клетки, и читать трубку на цитометре в течение дополнительных трех-пяти минут. Чтобы сенсибилизировать животных, доставить 200 микролитров экстракта арахиса, содержащего токсин холеры через устные gavage к каждому четыре-пять недель BALB / C женский получатель мыши один раз в неделю в течение трех недель и 300 микролитров разбавленного экстракта арахиса в четвертую неделю.
На 28 день, подготовить экстракт арахиса до окончательной концентрации одного миллиграмма на миллилитр в PBS, и использовать ректальный термометр для измерения базовой температуры тела каждого сенсибилизированного животного. Когда все температуры были измерены, управлять 200 микролитров экстракта арахиса для каждого получателя через внутриперитонеальной инъекции, и измерить температуру тела с ректальным термометром каждые 15 минут в течение одного часа после инъекции. Падение температуры тела указывает на аллергию на арахис.
После изоляции спленоцитов от мышей с аллергией на арахис используйте одноми миллилитровый инсулиновый шприц, оснащенный 27-дюймовой 5/8-дюймовой иглой, чтобы внутривенно вводить 1,5 раза в седьмую часть извлеченных аллергических спеноцитов в хвостовые вены наивных, несенсибилизированных животных. На следующий день после принятия передачи внутривенно вводят 200 микролитров антигенных липосом Ara h 2 в хвостовую вену каждой мыши BALB/c, которая получала аллергические спеноциты. Через две недели после инъекции липосомы, увеличить мышей с i.p.
инъекция растворимых Ара h 2, а затем 200-микролитер Ара h 2 вызов на день 61. Затем, измерить температуру тела с ректальным зондом каждые 15 минут, как попродемонстрировано. Спряжение протеина можно продемонстрировать путем бежать уменьшая гель показывая увеличение в молекулярном весе сравненном к unconjugated протеину.
Для оценки антигенных липосом-стимулировали B-клеточный поток кальция, ворота живых одиночных клеток, чтобы выбор B220-положительных CD5-отрицательных В-клеток. Соотношение индо-1 фиолетовый по сравнению с Индо-1 синий флуоресценции с течением времени могут быть проанализированы для оценки количества липосомы индуцированной B-клеточной активации. Количественная оценка Ara h 2-специфических IgE и IgG1 в сыворотке арахиса экстракт-сенсибилизированных мышей ELISA указывает на то, что мыши с присвоенной чувствительности, которые повышаются с Ара ч 2 экспонат измеримых Ара h 2-специфических IgE и IgG1 в их сыворотке.
Температура тела, зарегистрированная во время Ara h 2 вызов показывают, что аллергические мыши демонстрируют снижение температуры тела после вызова, в то время как температура тела у наивных мышей остаются последовательными. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы тщательно отслеживать количество липидных белков, связанных с включены в липосомы, так как слишком много белка может сделать экструзии трудно. После этой процедуры, другие методы, такие как отслеживание и сортировка аллерген-специфических В и Т-клеток могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как эти аллерген-специфические клетки реагируют на терапии.
Этот метод проложит путь для исследователей в области аллергии, чтобы исследовать новые иммунотерапии, которые борются с аллергическими заболеваниями с помощью этой модели мыши. Не забывайте, что работа с токсином холеры может быть опасной и что руководящие принципы для его использования должны соблюдаться в соответствии с местными институциональными стандартами биологической безопасности.
