Этот протокол позволяет в режиме реального времени визуализировать активность системной сигнальной системы растения путем мониторинга динамики кальция и апопластического глутамата в ответ на ранение. Этот общезаводской метод визуализации в режиме реального времени предоставляет надежный инструмент для понимания динамики быстрых и дальних сигналов в растениях, сочетая в себе высокое пространственное временное разрешение и простоту использования. Этот протокол предлагает потенциал для обеспечения нового понимания пространственных и временных характеристик системы передачи сигналов кальция как в биотических, так и в абиотических реакциях на стресс у других видов растений.
Продемонстрировать процедуру будет Такуя Уэмура, постдокторант из моей лаборатории. Начните с включения моторизованного флуоресцентного стереомикроскопа, оснащенного объективом 1X и камерой sCMOS. Настройте параметры устройства для облучения светом возбуждения, центрируемым на 470 нанометрах, выбранным с помощью фильтра, который пропускает свет от 450 до 490 нанометров.
Получайте излучающий свет с помощью фильтра, который пропускает от 510 до 560 нанометров. Снимите крышку с тарелки, содержащей растение, и поместите ее под объектив. Проверьте флуоресцентный сигнал от растения.
Затем подождите примерно 30 минут в темноте, пока растения не адаптируются к новым условиям окружающей среды. Отрегулируйте фокус и увеличение, чтобы увидеть все растение в поле зрения. Затем установите параметры сбора для обнаружения флуоресцентных сигналов с помощью программного обеспечения для визуализации микроскопов.
Установите время записи на 11 минут. Снимайте за пять минут до начала эксперимента, чтобы акклиматизировать растение к облучению синим светом из микроскопа, после чего начинают запись. Для определения среднего исходного уровня флуоресценции записывают не менее 10 кадров перед нанесением раны или нанесения глутамата.
Для визуализации в режиме реального времени раневых индуцированных цитозольных изменений концентрации ионов кальция и апопластического глутамата ножницами разрезают черешек или среднюю область листа L1. Для визуализации в режиме реального времени вызванных глутаматом цитозольных изменений кальция, ножницами отрежьте ножницами примерно один миллиметр от кончика листа L1 по главной вене. По крайней мере, через 20 минут нанесите 10 микролитров 100 миллимолярного глутамата на поверхность среза листа.
Для анализа интенсивности флуоресценции с течением времени определите интересующей область в месте, где должна быть проанализирована интенсивность флуоресценции. Определите два ROI для расчета скорости кальциевой волны. В программном обеспечении для визуализации нажмите на измерение времени, определите и обведите.
Измерьте расстояние между двумя областями, щелкнув по аннотациям и измерениям, длине и простой линии. Измерьте необработанные значения цветоскопии в каждом ROI с течением времени, щелкнув по мере, а затем экспортируйте необработанные данные в программное обеспечение для электронных таблиц, чтобы преобразовать флуоресцентный сигнал в числа в каждой точке времени. Определите базовое значение флуоресценции, которое определяется как F ноль, вычисляя среднее значение F за первые 10 кадров в записанных данных, затем нормализуйте данные F, как описано в текстовой рукописи.
Для анализа волн скорости кальция определите значительную точку подъема сигнала выше предварительно стимулированных значений как представляющую обнаружение увеличения кальция в каждом ROI. Рассчитайте разницу во времени увеличения кальция между двумя ROI и расстояние между ними, чтобы определить скорости любой кальциевой волны. Здесь показано распространение раневого изменения концентраций цитозольного иона кальция и апопластического глутамата.
Обрезка черешка листа у растений, экспрессивных GCaMP-3, привела к значительному увеличению кальция. Он был индуцирован локально, а затем распространился по всей сосудистой области. Сигнал быстро распространялся на соседние листья в течение нескольких минут.
При срезке листа и растений, экспрессивляющих основную хитиназу I клея нюхатель, вокруг среза наблюдалось быстрое увеличение апопластического глутамата. В течение нескольких минут сигнал также распространялся через сосудистую азкулятуру. Для визуализации распространения сигнала кальция в режиме реального времени, вызванного применением глутамата, край листа у растений, экспрессирующих CCaMP-3, срезали.
Это вызвало местное повышение концентрации цитозольного иона кальция, но сигнал исчез в течение нескольких минут. Примерно через 10 минут глутамат наносили на поверхность разреза, вызывая быстрое местное повышение концентрации цитозольного кальция и последующее распространение этого сигнала на дистальные листья. Для измерения изменений внутри твердой концентрации кальция, вызванной ранением в системном листе, изменение времени интенсивности сигнала GCaMP-3 измерялось в двух областях, представляющих интерес.
Также были измерены изменения концентрации апопластического глутамата в ответ на механическое повреждение. Сигнатаматная сигнатная сигната демонстрировала один пик примерно через 100 секунд после ранения. Этот эксперимент должен проводиться в условиях контроля температуры и влажности, поскольку они повышены изменениями в этих условиях окружающей среды.
Этот протокол предлагает потенциал для получения информации о молекулярных механизмах, лежащих в основе передачи сигналов на большие расстояния, с помощью мутантов, которые является дефектными и мнимыми элементами лабораторной сигнальной системы.
