This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Мы представляем детальные процедуры для работы с изображениями местных Ca 2+ события в человеческой нейробластомы SH-SY5Y клеток. Эти процедуры могут быть адаптированы к изображения внутриклеточного Са 2+ сигналов во многих типах клеток 8-10. 1. Подготовка клеток <ol><li> Культуры клеток для включения в образ в соответствии с инструкцией, приведенной на веб-сайте своего поставщика. </li><li> Через несколько дней до обработки изображений, урожай клеток, выращенных в культуре ткани колбу с использованием 1 мл 0,25% трипсина / EDTA (2-3 мин). После отрыва, добавить равный объем культуральной среды для инактивации трипсина. </li><li> Выполните подсчет клеток с использованием гемоцитометра и семян клеток в стеклянное дно блюд изображений при плотности 3-7 х 10 4 клеток на чашку. Выделите ячейки для экспериментов с изображениями, когда они достигают 60% слияния (2-3 дня). </li></ol> 2. Приготовление растворов и реактивов <ol><li> Подготовка Ca 2+ -содержащего HEPES в буфересолевой раствор (Са 2+ -HBSS) состоит из (мМ): NaCl 135, KCl 5,4, CaCl2, 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 глюкозы и; рН = 7,4 при комнатной температуре (RT) с помощью NaOH. Подготовка Ca 2+ -HBSS без добавления глюкозы и хранят при температуре 4 ° С; добавить глюкозы в растворе непосредственно перед использованием. </li><li> Солюбилизации мембранных проникающий формы флуоресцентного индикатора Са 2+ Cal-520 (1 мМ), CI-IP-3 (200 мкМ), и EGTA (100 мМ) в диметилсульфоксиде (ДМСО), содержащих 20% Pluronic F-127. Алиготе этих реагентов в пробирки Эппендорф и хранить, защищенных от влаги и света, при температуре -20 ° C. </li></ol> 3. Загрузка Клетки с мембраной проникающий Cal-520, CI-IP 3 и EGTA <ol><li> Подготовка &quot;загрузочного буфера&quot; путем разбавления исходных растворов мембран проникающий Cal-520 и CI-IP 3 до конечной концентрации 5 мкМ и 1 мкМ, соответственно, в Са 2+ -HBSS. </li><li> Отберите у.е.lture СМИ и промыть клетки, замену носителя с Са 2+ -HBSS три раза. </li><li> Удалить Ca 2+ -HBSS и инкубировать клетки в буфере для нанесения в течение 60 мин при комнатной температуре в темноте. </li><li> Удалить загрузки буфер и промыть клетки, замену носителя с Са 2+ -HBSS три раза. <ol><li> При желании на этом этапе, тензодатчики с EGTA / AM разбавлением исходного раствора в конечной концентрации 5 мкМ в Ca 2+ -HBSS а затем инкубируют клетки в течение 30-60 мин при комнатной температуре в темноте. После этого инкубирования промойте ячеек три раза Ca 2+ -HBSS затем переходите к шагу 3.5. </li></ol></li><li> Инкубируйте клетки в Ca 2+ -HBSS в течение 30 мин, чтобы обеспечить деэтерификации загруженных реагентов. </li><li> Непосредственно перед визуализации, заменить Са 2+ -HBSS с &quot;свежей&quot; Ca 2+ -HBSS, чтобы удалить какой-либо краситель, который мог бы утечка в ванне во время конечного инкубации. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Приобретение изображения <ol><li> Поместите небольшую каплю иммерсионного масла на цели 100X APO TIRF (NA 1.49). </li><li> Установите блюдо изображений на этапе инвертированного микроскопа и принести клеток в фокусе, используя проходящем свете. Важно, чтобы обеспечить блюдо изображений, чтобы предотвратить движение во время записи. </li><li> Осветить клетки с 488 нм лазера, чтобы возбудить Cal-520 и собрать излучаемую флуоресценции (λ&gt; 510 нм), используя высокоскоростной EMCCD камеру. ПРИМЕЧАНИЕ: пакет программного обеспечения, который работает микроскоп позволяет пользователю перевести фокусирующей линзы, позволяющие лазерный луч, чтобы быть введены либо на самом краю объективной обратной диафрагму (для TIRF возбуждения) или ближе к центру (для &quot;WF&quot; возбуждения). </li><li> Использование программного обеспечения EMCCD, уменьшить поле изображения с полным 512 х 512 пикселей для того, чтобы собирать данные по необходимой временным разрешением, чтобы захватить локальные Ca 2+ события. ПРИМЕЧАНИЕ: Например, центр Quadприобретение 256 х 256 пикселей ускоряет процесс приобретения до 66 кадров в секунду. Кроме того, можно дополнительно увеличить частоту кадров EMCCD камеры к 500 кадров в секунду с использованием изолированного функция режима урожай. </li><li> Настройка программного обеспечения для автоматической записи несколько секунд базовой деятельности, доставить УФ вспышки в клетки и продолжить запись еще 10-30 сек. Примечание: УФ флэш поставляется с использованием ксеноновой дуговой источник света вводится через УФ отражающей дихроичное зеркало в задней порта микроскопом. Продолжительность и интенсивность УФ-вспышки регулируется эмпирически, чтобы вызвать желаемую частоту местных Са 2+ событий. </li><li> Сохранить файлы в качестве изображения стеки для анализа в автономном режиме. </li></ol> 5. Автоматизированная Ca Анализ 2+ изображения ПРИМЕЧАНИЕ: Можно просматривать, обрабатывать и анализировать полученные данные с помощью многих коммерческих программных пакетов. Тем не менее, мы разработали алгоритм для быстрого автоматизации идентификациейd анализ локальных Ca 2+ сигналов. Подробное описание пространственных и временных фильтров, используемых в данном алгоритме, генерация подпрограмм; F / F 0 и идентификации / анализа можно найти в 11. Этот алгоритм был разработан для работы на платформе программного обеспечения с открытым исходным кодом Python, и могут быть получены, вместе с образцами экспериментальных данных и подробные инструкции пользователей, по электронной почте об авторе (ismith@uci.edu). <ol><li> Преобразование файлов, которые будут импортированы в специально написанный алгоритм в формат файла Multi-самолета .tiff. </li><li> Найдите папку, содержащую алгоритм анализа и дважды щелкните run.exe. </li><li> Выберите .tiff файл для анализа. </li><li> Выберите параметры анализа в диалоговом окне Открыть. Смотрите рисунок 2А для параметров по умолчанию для выборки данных. </li><li> Определить уровень черного, которые будут компенсированы из стека изображения либо перемещении курсора на части поля зрения, что делает пOT содержать ячейку (рис 2б) или вручную, путем ввода уровень черного, используя &quot;Set Уровень черного строки. </li><li> Соблюдайте четыре окна на экране после анализа программного обеспечения (рис 2С-F). С монохромный образ отдыха флуоресценции из клеток анализируется. Белые квадраты, наложенные на этой фотографии являются места событий, определяется как центра тяжести позиций двумерных гауссовых функций, установленных на события. </li><li> Нажмите на каждом месте события или нажмите клавиши курсора для переключения между событиями. После выполнения этого фон вычитается, Gaussian сглаживаются изменения соотношения флуоресценции (; F / F 0) в каждой из этих сайтов обновлений в окне D. ПРИМЕЧАНИЕ: красным цветом события полны решимости происходят из этого конкретного сайта, а не из «просачивание через&quot; от деятельности локализованного в соседние сайтов. Нижний синий след указывает, где сигнал флуоресценции в выбранном месте превышает обнаруженияПорог, в то время как черные линии определяет события, происходящие из этого конкретного сайта (в соответствии с красным цветом события). </li><li> Нажмите на красным цветом событие для обновления окна E, который отображает временную эволюцию события, а окна F, который отображает пространственный профиль случае, усредненная по ее течения времени, вместе с пространственным профилем оборудованной функцией Гаусса. </li><li> Вручную просмотреть события, которые были определены таким образом, чтобы артефакты могут быть отклонены из анализа. Удалить такие события, щелкнув правой кнопкой мыши красным цветом события. ПРИМЕЧАНИЕ: В наших руках, Ca 2+ поток через отдельные каналы IP 3 R вызывает сигналы с; F / F 0 о 0,11, так что, скорее всего, ложные срабатывания любых обнаруженных «события» заметно меньше, чем это. </li><li> Экспорт данных, выбрав пункт &quot;Сохранить Excel&quot; или экспортировать данные на чейно, опираясь вокруг клеток, представляющих интерес и выбрав &quot;Сохранить CellR17 ;. Примечание: Данные сохраняются в той же папке, что и оригинальный стек изображений. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication.">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling.">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li><li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling).">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li><li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate.">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca(2+)+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li><li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Здесь мы опишем протоколов для работы с изображениями местных Ca 2+ события в культивируемых клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca 2+ показателей. Кроме того, мы опишем алгоритм с интуитивно понятным пользовательским интерфейсом, который позволяет автомат...

Ионы кальция (Ca 2+) повсеместно регулировать широкий спектр биологических процессов, в том числе генной экспрессии, секреции и длительных изменений в синаптической пластичности 1. Один из способов, через которые Са 2+ может действовать таким разнообразным образом через различных пространственных и временных форм Ca 2+ сигналы клеток может генерировать. Например глобальных высот в цитозоле [Са 2+] триггера сокращения в гладкой мышечной ткани 2, тогда как более мелкие, локальные переходные высоте (местные Ca 2+ Микродомены) стимулировать экспрессию генов, необходимую для обучения и памяти 3. Бесплатный цитозольный [Ca 2+] поддерживается на ~ 100 нм в покое, но может быстро подняться до нескольких микро-моляра после притока Ca 2+ в цитозоле через Са 2+ -permeable ионные каналы, расположенные в мембране и освобождение Са 2+ из внутриклеточных сTores. В нашей лаборатории фокусируется на инозитол 1,4,5-трифосфата рецептора (IP-3 R), который образует канал выпуска 2+ Ca, расположенной в эндоплазматический ретикулум (ER) мембраны. После связывания как IP 3 и Са 2+ в цитозоле активации сайты рецептора, R канал IP 3 открывает освободить Ca 2+ поглощенных в ER просвет. Релиз Ca 2+ может оставаться пространственно ограничена небольшим кластера IP 3 рупий для создания местного цитозольную микродоменной Ca 2+ (Ca 2+ слоеного 4) или, в зависимости от близости соседних кластеров IP 3 R, может распространяются по всей клетке, привлекая множество сайтов слоеные с помощью процесса, Са 2+, индуцированной Ca 2+ -release (CICR) 5,6. Введение флуоресцентных маленькая молекула Са 2+ индикатор красителей разработана Роджером Tsien 7, в сочетании с передовой микроскопии томографовнг методы, значительно облегчило наше понимание Ca 2+ сигнализации. Последние достижения в области камер, используемых для микроскопии позволяют сейчас для визуализации переходных местных Ca 2+ события, такие как клубы с беспрецедентной пространственным и временным разрешением. Имеющиеся в настоящее время EMCCD камеры позволяют изображений с 128 х 128 пикселей при&gt; 500 кадров с -1 (кадров в секунду) и новое поколение дополнительной полупроводника из оксида металла (CMOS) камеры обеспечивают более высокое разрешение в пикселях, и даже более высокую скорость за счет немного выше уровень шума. В сочетании с полного внутреннего отражения (TIRF) микроскопии стало возможным с изображением одного Ca 2+ события 8,9 каналов. Такой подход позволяет визуализации сотен каналов / событий одновременно, при создании больших наборов данных (около 1 Гб в минуту), которые делают ручную обработку, визуальную идентификацию и анализ непрактичным и разместить ответственность на разработке автоматизированных алгоритмов. 2+ сигналы в интактных клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca 2+ показателей. Кроме того, мы продемонстрировать алгоритм, разработанный в среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует идентификацию и анализ локальных Ca 2+ событий, отображаемых как TIRF и обычные широкое поле эпи-флуоресценции (WF) микроскопии. Хотя мы опишем эти подходы в контексте ИС 3 -порожденная Ca 2+ сигналы, они легко поддаются изучению локальных изменений в цитозоле [Са 2+], исходящие из различных Са 2+ -permeable ионные каналы, расположенные в любом поверхности мембрану или внутриклеточные органеллы 8-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:813px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cal-520/AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21130</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>cag-iso-2-145-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO/20% pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA/AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E-1219</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom imaging dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Цитозольного Ca 2+ регулировать многие аспекты клеточной активности практически во всех типах клеток, контролируя процессы, широкие, как транскрипции генов, электрической возбудимости и пролиферации клеток. Разнообразие и специфичность Ca 2+ сигналов происходит от механизмов, посредством которых Ca 2+ сигналы генерируются действовать в течение различных временных и пространственных масштабах, начиная от сотовых всей колебаний и волн, происходящих в течение периодов от нескольких минут до местных переходных Ca 2+ микродоменов (Ca 2+ клубы) длительностью миллисекунд. Последние достижения в области электронного умножается CCD (EMCCD) камеры в настоящее время позволяют для работы с изображениями местных Ca 2+ сигналов с 128 х 128 пикселей пространственным разрешением со скоростью&gt; 500 кадров с -1 (FPS). Такой подход чрезвычайно параллельный и позволяет одновременный мониторинг сотен каналов или слоеного сайтов в одном эксперименте. Тем не менее, огромное количество данных, полученных (около 1 Гб PER мин) оказывать визуальную идентификацию и анализ местного Ca 2+ события невыполнимую. Здесь мы опишем и продемонстрируем процедуры для приобретения, обнаружения и анализа местного IP 3 опосредованной Са 2+ сигналы в интактных клетках млекопитающих, нагруженных Са 2+ показателей в обеих широкого поля эпи-флюоресценции (WF) и полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия. Кроме того, мы опишем алгоритм, разработанный в рамках программной среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует выявление и анализ этих местных Ca 2+ сигналов. Алгоритм локализуется сайты Ca 2+ выпуска с разрешением суб-пикселей; позволяет отзыв пользователем данных; и выводит временные последовательности отношение флуоресцентных сигналов вместе с амплитудой и кинетических данных в Excel-совместимый таблице.

1А показывает WF образ отдыха флуоресценции Cal-520 в нейробластомы человека SH-SY5Y, также загружаются с CI-IP 3. Воздействие этих клеток к 100 мсек УФ вспышкой фото-выпуска I-IP-3 вызвало переходные Ca 2+ затяжек на дискретных участках, обозначенных (белые кружки на фиг.1...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Изображений Локальный ЦС<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в культуре клетках млекопитающих

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K Views.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Video: Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Долгосрочные изображений клетках млекопитающих использованием широкого поля микроскопии

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Методы для работы с изображениями Ca 2 + Сигнализация в человеческой спермы

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

МИССИЯ esiRNA для скрининга RNAi в клетках млекопитающих

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Анализ сотового Позиция цикла в клетках млекопитающих

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Визуализация эндоплазматической сети субдоменов в культивируемых клетках

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Автоматизированный анализ динамических Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в последовательности изображений

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.