Этот протокол представляет собой новый метод культивирования и поддержания культур эпидермальной сферы, а также стратегию их тщательного исследования с использованием анализа сфероидной ремайлинги. Начните с приготовления моющего средства, как описано в тексте рукописи. В ламинарной вытяжке дважды промыть крайнюю плоть новорожденного пятью миллилитрами промывной среды в конической трубке с пятью миллилитрами, затем перенести промытую крайнюю плоть в стерильную чашку Петри.
С помощью скальпеля и щипцов соскоблите жировую ткань и рыхлые соединительные ткани с дермального слоя, затем промыть предочную плоть промывочной средой. Поместите эпидермис конечной плоти стороной вверх в шестискважную пластину, содержащую два миллилитра фермента Диспазы, разбавленного в промывочных средах. Переложите тарелку в инкубатор на четыре часа.
После инкубации перенесите крайнюю плоть в чашку Петри и используйте тонкие щипцы, чтобы отделить эпидермис от слоя дермы. Поместите эпидермис в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую два миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА. Раздавите плавающий эпидермис с помощью пятимиллилитровой серологической пипетки и высиживайте ее в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия с периодическим вихрем в течение пяти секунд каждые пять минут.
После инкубации добавляют два миллилитра ингибитора трипсина сои и смешивают его путем пипетирования для нейтрализации трипсина, затем центрифугируют клеточную суспензию. Повторно суспендировать гранулу в 12 миллилитрах полной среды KSFM-SCM и накрыть ячейки в 10-сантиметровую чашку для инкубации в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день снимите среду с помощью аспирирующей пипетки и замените ее 12 миллилитрами полного KSFM-SCM.
Повторите это на четвертый и седьмой дни. Приготовьте 5% смесь агарозы, добавив 2,5 грамма агарозы к 50 миллилитрам PBS в стеклянной бутылке на 100 миллилитров. Автоклавьте бутылку в жидкостный цикл и дайте ей остыть до комнатной температуры.
Для приготовления пластин поместите охлажденное стекло, содержащее раствор агарозы, в литровый стакан, наполненный 200 миллилитрами деионизированной воды. Расплавите смесь агарозы в микроволновой печи исследовательского класса в течение двух минут, перемешивая агарозу каждые 60 секунд, осторожно наклоняя бутылку из стороны в сторону. Добавьте три миллилитра расплавленной 5%-агарозы к 12 миллилитрам предварительно выровненного KSFM-SCM при 42 градусах Цельсия для конечной концентрации 1% агарозы.
Добавьте 200 микролитров 1%-агаровой смеси в каждую лунку 96-луночного листа с помощью многоканального пипетки. Затем оставьте пластину в стерильной среде при 25 градусах Цельсия на четыре часа. Прохождение сфероид-образующих нормальных кератиноцитов человека путем аспирации сред и промывки клеток в двух миллилитрах PBS.
Аспирировать PBS и добавить два миллилитра 0,25% трипсина-ЭДТА к промытым клеткам. Затем инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. После инкубации добавьте в пластину два миллилитра ингибитора трипсина сои и промойте клетки с пластины в 15-миллилитровую трубку.
Центрифуга в 250 раз G в течение пяти минут. Повторно суспендируйте гранулу клетки в одном миллилитрах PBS и количественно оцените клетки с помощью окрашивания Trypan Blue. Aliquot 20 000 нормальных кератиноцитов человека в 100 микролитрах KSFM-SCM и посев клеток в каждую лунку ранее подготовленной 96-луночной пластины.
Затем высиживают тарелку в течение ночи. С помощью перевернутого фазово-контрастного микроскопа проанализируйте засеянные скважины на формирование сферы эпидермиса. Через 24-48 часов после формирования сферы 3D эпидермиса добавьте четыре миллилитра предварительно выровненного KSFM-SCM при 37 градусах Цельсия в шестисантиметровую тарелку.
Используя широкий отверстие с одним миллилитром наконечника пипетки, перенесите один сфероид на пластину и высиживайте пластину в течение ночи. Проанализируйте семенной сфероид для прикрепления или размножения клеток с помощью инвертированного фазового контрастного микроскопа. Подавая ячейки каждые 96 часов, удаляя носитель и добавляя два миллилитра свежих носителей KSFM-SCM в тарелку.
Прохождение от 70 до 80% слиюнного сфероидного происхождения нормальных кератиноцитов человека и 2D монослойных культур, как было продемонстрировано ранее. Затем количественно оцените жизнеспособность клеток с помощью Trypan Blue и автоматизированного счетчика клеток. Aliquot 100 микролитров, содержащих от 100 000 до 4 миллионов нормальных кератиноцитов человека в 1,5 миллилитровых микроцентрифужных трубках.
Поместите трубки на лед в темной среде, выключив яркий свет в ламинарной вытяжке. Добавьте два микролитра FITC-конъюгированного анти-интегрина альфа-шестерки и два микролитра PE-конъюгированного анти-EGFR в пробирки для достижения разведения от одного до 50. Подготовьте трубку без добавления антител, чтобы служить в качестве незапятнанный контроль.
Высиживать трубы на льду в темноте в течение 30 минут. Выполните анализ проточной цитометрии с помощью соответствующих лазеров. Используйте отрицательные и позитивные элементы управления для установления ворот.
Отсортируйте субпопуляцию фракции эпидермальных стволовых клеток, фракцию пролиферативных клеток-прогениторов и фракцию клеток-прогениторов. Тест на пролиферативную способность отсортированных клеточных субпопуляций путем переноса содержимого каждой соответствующей сортировочной трубки в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую в 10 раз больше объема отсортированных клеток в PBS. Центрифугировать трубки в 250 раз G в течение пяти минут.
Удалите супернатант и повторно суспендируем гранулу в четырех миллилитрах KSFM-SCM. Перенесите повторно суспендированные клетки на шестисантиметровую пластину и инкубируют в течение ночи при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа с 5% влажностью 95%. На следующий день удалите носитель с пластин и добавьте четыре миллилитра предварительно выровненного KSFM-SCM при 37 градусах Цельсия каждые три дня, пока не будет достигнуто слияние от 70 до 80%.
Автономная эпидермальная сферообразующая способность нормальных кератиноцитов человека в 3D культуре оценивалась с помощью анализа сферы эпидермиса кожи. Несферическая агрегация клеток не рассматривалась как адекватное формирование сферы эпидермиса. Плотная сферообразная агрегация считалась отличительной чертой спонтанного сфероидного образования.
Необходимо было использовать более двух раз по 10 на четыре клетки, чтобы обеспечить надлежащую спонтанную агрегацию. Посадка сфер эпидермиса в 2D культуру привела к пролиферации малогабаритных жизнеспособных нормальных кератиноцитов человека. Важно поддерживать эти культуры ниже 100% слияния, так как это может значительно ухудшить их рост и состояние стволовых клеток в культуре.
Процесс образования эпидермальных сфероидов функционально отслеживался на уровне одной клетки трансфекционерными клетками с флуоресцентным репортером. Субпопуляция нормальных кератиноцитов человека, полученная из сфероидов, является интегрином альфа шесть высоким, а EGF - низкими клетками. Клетки обычно составляют около 25% культур.
Характеристика этой стеблеподобной субпопуляции кератиноцитов была достигнута иммуноокрашающим анализом базального цитокератина 14 и опухолевого белка 63. Анализ сфероидной рематировки является эффективной стратегией обогащения эпидермальных стволовых клеток из кожи неонатального человека. Эта система может быть использована в качестве высокопроизводительной клеточной модели для исследования кожных заболеваний, таких как заживление ран и рак.
