Этот анализ визуализации in vitro позволяет количественно оценить влияние различных клеточных методов лечения или различных генотипов на фагоцитоз микроглии. Используя два типа клеток, которые имеют отношение к нейродегенеративным заболеваниям, мы используем мертвые клетки нейробластомы для фагоцитарного груза, которые готовятся таким образом, что их можно легко и дешево масштабировать с помощью больших экранов изображений с высоким содержанием. В шкафу биологической безопасности класса 2 диссоциируют SH-SY5Ys путем аспирации среды.
Добавьте 4 мл буфера диссоциации клеток и немедленно удалите буфер так, чтобы менее 1 мл оставалось в виде тонкой пленки, покрывающих клетки. Инкубировать в течение 2-3 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Затем по 10 мл HBSS в колбу Т-75.
И пипетка SH-SY5Ys в коническую центрифужную трубку 15 мл. Центрифуга при 400xG в течение 5 минут. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливайте клетки в 2 мл фенольной буферной среды HEPES без красного цвета, обязательно разбивая сгустки перед фиксацией.
Зафиксируйте клетки, добавив в трубку 2 мл формальдегида 4% мощности и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре с периодическим мягким перемешиванием. Добавьте в туб 10 мл HBSS. Затем центрифугировать при 1200xG в течение 7 минут.
Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 2 мл фенольного красного цвета hePES буферной среды. Подсчитайте и удалите 1 миллион клеток HS-SY5Y в трубку с низким содержанием белка 2 мл. Доведите общий объем до 300-500 микролитров с помощью фенольных буферизованных сред HEPES без красного цвета.
Затем ненадолго нагрейте трубку на водяной бане 37 градусов цельсия. Восстановлен pH-чувствительный красный флуоресцентный краситель STP эфир в соответствии с инструкциями производителя. Затем добавьте 12,5 мкг красителя на миллион sh-SY5Y клеток.
Осторожно перемешайте, щелкнув тюбик. И высиживают трубку при комнатной температуре в течение 30 минут, защищенные от света. Добавьте 1 мл HBSS и центрифугу при 1200xG в течение 7 минут и 4 градусов Цельсия.
Выбросьте супернатант. И промыть 2 мл HBSS. Повторно суспендировать клеточную гранулу в фенольных средах макрофагов без красного цвета до концентрации от 0,2 до 1,2 миллиона клеток на мл, так что 50 микролитров содержат от 10 000 до 60 000 клеток.
В шкафу биологической безопасности готовят раствор темно-красного флуоресцентного клеточного проницаемого сукцинимидилового эфиро-реакционноспособного красителя в макрофаговой среде. Добавьте Hoechst 33342, и разогрейте рабочий раствор до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Аспирировать среду макрофагов iPSC осторожно, пипетируя клеточный супернатант многоканальной пипеткой в стерильный резервуар.
Добавьте 70 микролитров на лунку раствора красителя к макрофагам iPSC с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать в течение 1 часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Восстановительные экспериментальные методы лечения в фенольных средах макрофагов без красного цвета.
После инкубации очень аккуратно аспирировать среду iPSC макрофагов многоканальной пипеткой и добавить 100 микролитров HBSS на лунку. Немедленно удалите HBSS путем мягкой пипетки. Затем добавьте 100 микролитров фенольных сред макрофагов без красного цвета, а также экспериментальные обработки в отдельных лунках.
Инкубировать в течение 10 минут до 1 часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 50 микролитров меченого SH-SY5Ys на лунку со сторон каждой скважины на краю жидкости. Затем инкубируют при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 3-5 часов.
После инкубации фагоцитоза осторожно аспирируют клеточные супернатанты путем пипетки многоканальной пипеткой и выбрасывают. Мойте один раз 100 микролитрами PBS. Затем зафиксируйте клетки, добавив 100 микролитров формальдегида 2% мощности и инкубируя в течение 15 минут при комнатной температуре.
Аспирировать лунки и добавить 100 микролитров PBS. Либо приступайте непосредственно к визуализации с помощью микроскопа с высоким содержанием, либо накройте пластинчатым герметиком и фольгой и храните пластину при 4 градусах Цельсия, пока это не потребуется. Включите микроскоп с высоким содержанием изображений и откройте программное обеспечение для захвата изображений.
Загрузите пробирную пластину в микроскоп, нажав на значок LOAD в верхней части экрана. Выберите вкладку SETUP". В раскрывающихся меню в левом верхнем углу выберите соответствующий тип пластины.
Опция автофокусировки: два пика"Цель: 40x Вода, NA 1.1"Конфокальный" режим и Биннинг 1. Очистите объектив 40x Water перед использованием через меню настроек. В поле выбора канала используйте значок плюса, чтобы добавить каналы DAPI, Alexa 647 и Alexa 568.
Установите их для измерения в одной плоскости в один микрометр. Оптимизируйте настройки времени и мощности для повышения эффективности окрашивания пробирной пластины. Убедитесь, что каналы не измеряются одновременно, щелкнув последовательность каналов, чтобы отделить каналы.
В разделе навигации и определения макета выберите скважины для измерения и выберите от 9 до 12 месторождений на скважину. Во время настройки нажмите на репрезентативное поле на карте пластин. И проверьте каждый измерительный канал по очереди, чтобы убедиться, что окрашивание присутствует, и что изображения фокусируются, регулируя смещение канала.
Чтобы загрузить данные на сервер для удаленного анализа, нажмите на поле «Онлайн-задания» и соответствующее имя экрана. Сохраните протокол анализа, нажав на кнопку «Сохранить», и нажмите на вкладку «Запустить эксперимент» вверху. Анализ фагоцитоза живых клеток показал, что при 10 000 SH-SY5Ys на скважину количество частиц фагоцитозы на клетку линейно увеличивалось со временем и ингибировалось примерно на 50% цитохалазином D. При более высоких количествах SH-SY5Ys на скважину фагоцитоз проявлял плохую линейность, вероятно, из-за плохой сегментации iPSC, макрофаги и SH-SY5Ys в более переполненном поле зрения.
Следующие результаты были получены путем выполнения визуализации с высоким содержанием фиксированных клеток, включая это репрезентативное изображение фагоцитоза. Увеличение количества SH-SY5Ys привело к увеличению количества фагоцитозированных частиц на клетку. Анализ фагоцитоза был подтвержден с использованием нескольких ингибиторов фагоцитоза.
Цитохалазин D и Jasplakinolide значительно ингибировали фагоцитоз на 91 и 90 процентов соответственно. А бафиломицин А1 значительно уменьшал фагоцитоз на 31% при предварительной инкубации за 1 час до фагоцитоза. Добавление рекомбинантного аннексина 5 значительно уменьшало фагоцитоз на 30% при добавлении в колодцы непосредственно перед добавлением SH-SY5Y.
Исправлено SH-SY5Ys, мы подтвердили, что подвергаем воздействию фосфатидилсерина с помощью флуоресцентного зонда Annexin 5. В то время как живые SH-SY5Y были отрицательными для окрашивания Приложением 5. Несколько длин продолжительности фагоцитоза, от 1 до 5 часов, были протестированы с использованием поэтапного добавления фагоцитарного груза.
Общая длина этого протокола может быть сокращена путем подготовки фагоцитарного груза и окрашивания макрофагов iPSC параллельно. Если вы хотите сделать это, заранее проработайте сроки и используйте свои инкубаторы для подготовки решений для будущих шагов.
