Этот протокол позволяет наблюдать функции вкусовых клеток в естественной микросреде с сохранением нейронных связей и кровообращения. Используя этот метод, межклеточная связь может быть исследована in vivo. Для начала заполните резервуары перфузионной системы сжатым потоком искусственной слюной и вкуснятными веществами.
Подключите линию сжатого воздуха к входу регулятора и установите давление воздуха в системе подачи жидкости на 30-50 фунтов на квадратный дюйм. Установите выходное давление регулятора на 0,4 фунта на квадратный дюйм и проверьте, начинает ли жидкость вытекать из трубки. Подключите коллектор из резервуаров к входному порту микроязыка, затем подключите выходной порт микроязыка к шприцевым насосом и отведите жидкость со скоростью примерно 300 микролитров в минуту, чтобы установить состояние устойчивого состояния.
Убедитесь, что объем капли, висящей под микроязычком, остается постоянным, и отрегулируйте давление воздуха и скорость потока для получения желаемой высоты образца. После настройки микрофлюидной системы отсоедините линию сжатого воздуха и выключите шприцевой насос до тех пор, пока мышь не будет подготовлена к визуализации in vivo. После введения анестезии мыши внутривенно вводят ТРИТК-декстран через ретро-орбитальный путь для наблюдения за кровообращением во время визуализации.
Поместя мышь в положение лежа на спине, распылите 70% этанола на ее голову. Используйте щипцы, чтобы слегка подвискать кожу головы, затем используйте ножницы, чтобы отрезать примерно семь квадратных миллиметров кожи. После очистки волос вокруг кожи головы удалите из-под кожи околоушную кость и нанесите мгновенный клей на череп.
Затем прикрепите настроенный фиксатор головы. Как только мгновенный клей затвердеет, нанесите зубной клей вокруг головного фиксатора и затвердите его путем освещения синим светом. Используя мгновенный клей, чтобы приклеить нижнюю губу мыши к нижнему блоку микроязыка, затем поместил мышь на доску подготовки мыши и закрепил нижний блок на микроязычке к удерживающим стойкам, выровняв отверстия на краю микроязыка с стойками.
Затяните фиксатор головки мыши к держателю головки на плате и отрегулируйте расстояние между головкой мыши и устройством. Затем, используя держатель для крепления головки, плавно поверните головку мыши примерно на 45 градусов. Прикрепив мышь к доске, используйте пластиковый пинцет, чтобы аккуратно нарисовать ее язык.
Затем, используя мгновенный клей, прикрепите вентральную сторону языка к верхней стороне нижнего блока микроязыка. Чтобы язык был влажным, протрите поверхность влажным ватным тампоном, затем поместите кусочек ткани, пропитанный искусственной слюной, на открытую поверхность языка. Поместите изогнутые шайбы на стойки, удерживая нижнюю часть микроязычков, затем переместите подготовку мыши на стадию микроскопа.
Расположите открытый язык мыши под приблизительным центром объектива микроскопа, следя за тем, чтобы не отклоняться от динамического диапазона сцены, затем затяните винты, чтобы прочно прикрепить доску мыши к сцене. Поместите грелку под мышь, чтобы поддерживать температуру ее тела между 36,5 и 37,5 градусами Цельсия. Чтобы предотвратить попадание жидкости в трахею мыши, поместите тонкий кусок скрученой бумаги внутрь рта мыши, затем удалите влажную ткань, помещенную на поверхность языка, и поместите подготовленный микроязык на язык мыши, чтобы поверхность языка была видна через окно визуализации.
Закрепите микроязычок, аккуратно завинтив оба конца с минимальным давлением сжатия. Чтобы начать получать изображения, откройте программное обеспечение микроскопа, затем включите двухфотонный лазер на 920 нанометров. Установите объектив погружения в воду на микроскоп, затем опустите объектив на окно визуализации микроязыка и погрузите объектив.
В режиме камеры осветить поверхность языка, включив синий свет от ртутной лампы. Чтобы найти приблизительную фокальную плоскость, отрегулируйте ось Z и найдите сигнал автофлуоресценции от нитевидных сосочков. Затем с помощью регуляторной ручки X и Y найдите вкусовой рецептор.
Переключитесь в многофотонный режим, затем задайте длину волны возбуждения, набор фильтра излучения, режим сканирования и размер кадра для получения изображения. Со вкусовым рецептором в центре окна визуализации распокажите кровеносные сосуды, окружающие вкусовую рецептор, примерно на две трети высоты вкусовой рецептора и визуализируйте кровообращение. Если кровоток забит, слегка ослабьте фиксирующие винты, чтобы возобновить кровоток.
Отрегулируйте ось Z, чтобы найти Z-плоскость вкусовой рецептора, содержащей достаточное количество вкусовых клеток, затем приступайте к визуализации кальция при двух-шести герцах в течение 80 секунд. После начала визуализации включите резервуар жидкостной системы, чтобы обеспечить вкусовое решение в течение 20 секунд. После 20 секунд стимуляции вкуса переключите резервуар обратно на искусственную слюну.
Во время визуализации подождите около трех-четырех минут между сеансами, последовательно обеспечивая искусственную слюну, чтобы сохранить язык влажным и смыть вкус, оставшийся от предыдущего сеанса. Поверхность языка мыши Pirt-GCaMP6f-tdTomato покрыта автофлуоресцентными нитевидными сосочками и разрозненными вкусовыми рецепторами. Нитевидные сосочки желтого цвета захватываются с помощью фотодетектора на глубине от 500 до 550 нанометров и могут наблюдаться с самой поверхности языка глубиной до примерно 25 микрометров.
Сигналы GCaMP зеленого цвета, обнаруженные фильтром от 500 до 550 нанометров, и сигналы tdTomato красного цвета, обнаруженные фильтром от 607 до 670 нанометров, представляют вкусовые ячейки. Сигнал tdTomato получен для метрического анализа соотношения. Кровеносные сосуды, которые окружают вкусовую рецептор, приобретаются с помощью фильтра от 500 до 550 нанометров, установленного в коллагеновой соединительной ткани, который структурно поддерживает вкусовую рецептор, приобретается с помощью набора фильтров от 447 до 460 нанометров.
В этом репрезентативном примере скрининга вкуса in vivo с использованием кальциевой визуализации каждая вкусовая клетка разграничена пунктирными линиями. В этом испытании клетка 2 реагировала как на сладкие, так и на вкусные вкусители умами. И клетка 3 реагировала как на вкусные вещества с низким, так и на высокое содержание соли.
Ни одна из клеток в этом вкусовом рецепторе не реагировала на кислые вкусы. Поскольку целью данного эксперимента является наблюдение за функцией вкусовых клеток в естественной среде, важно доставить флуоресценты в кровеносные сосуды на этапе подготовки и подтвердить их циркуляцию во время эксперимента.
