Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в неврологии, особенно те, которые связаны с образованием гнезда нейронов. Основным преимуществом этой методики является то, что исследователи могут анализировать морфологические изменения отдельных нейронов у живых неонатальных мышей. Начните с анестезированной послеродовой день пять щенка и продолжить только при отсутствии реакции на тест щепотку хвоста.
Во-первых, стерилизовать кожу головы, вытирая его 70% этанола. Затем используйте ножницы стерилизованные с 70% этанола, чтобы удалить около 20 квадратных миллиметров кожи, покрывающей череп. Затем используйте стерильные типсы и чистый ватный тампон, пропитанный буфером коры головного мозга, чтобы удалить фасцию черепа.
Используйте наконечник загрузки, чтобы применить клей ткани к наклонной поверхности кожи, чтобы остановить кровотечение, избегая при этом области, которые будут изображены. Поместите щенка на другую грелку, установленную до 37 градусов по Цельсию, и дайте ему оправиться от анестезии. Подождите около 30 минут, пока клей ткани высохнет и затвердеет.
Как только клей ткани высохнет, начните подготовку черепного окна на повторно анестезироваемой мыши. Нанесите одну каплю буфера коры на череп, затем используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы тщательно открыть область диаметром один миллиметр черепа, оставив дуру нетронутой. Нанесите буфер коры, чтобы сохранить поверхность мозга влажной.
Используйте небольшой кусочек желатиновой губки, пропитанной буфером коры, чтобы остановить кровотечение. Используйте свежий кусок, чтобы сжать одну сторону краниотомии и слить любой буфер и кровь из дуральной поверхности, не касаясь дуры. Это самый важный шаг для подготовки четкого окна.
Дура должна быть неповрежденной и кисть должна быть удалена из открытой дуры. Затем используйте наконечник пипетки, чтобы нанесите тонкий слой в один процент низкоплавильной агарозы, растворенный в буфере коры головного мозга. Нанесите круглую трехмиллиметровую стеклянную крышку на слой агарозного геля.
Удалите все пузырьки между крышкой скольжения и агарозы гель слой, наливая сверх агарозы гель между ними. Используйте пинцет, чтобы удалить избыток геля, выступающий из-под крышки скольжения. Смешайте цементный порошок и цементную жидкость.
Используйте наконечник пипетки, чтобы применить смесь к черепу, прежде чем он затвердеет. Затем прикрепите изготовленный на заказ титановый бар к черепной кости с помощью зубного цемента. Выровняйте титановый бар, и крышка скользит параллельно, чтобы легко захватить изображения.
Обложка подвергаются черепа с зубным цементом. Затем подкожно вводят обезболивающее. Поместите щенка в клетку восстановления на 37 градусов по Цельсию тепловой площадки в течение часа, пока зубной цемент затвердеет.
Чтобы начать визуализацию, сначала установите двухкориновую лазерную длину волны. Для возбуждения RFP используйте длину волны 1000 нанометров. Протрите поверхность крышки скольжения с 70% этанола.
Прикрепите обезболивающего щенка к титановой пластине на стадии визуализации, используя титановый батончик. Используйте этап гониометра, чтобы настроить голову, так что крышка скольжения параллельно объектива. Поддерживайте температуру тела щенка во время визуализации с помощью грелки, установленной до 37 градусов по Цельсию, и уменьшите концентрацию изофлюрана до 0,7%-1%Поместите стадию визуализации под 20-х объективом двух фотонной микроскопа.
Нанесите одну каплю воды на крышку скольжения. Установите программное обеспечение для получения изображений с интервалом в 1,4 микрона. Для визуализации нейронов слоя 4 установите ширину от 150 до 300 микрон для изображения всей дендритической морфологии.
Используйте медленное сканирование и усреднение, чтобы получить четкие изображения, показывающие нейрональной морфологии. Это обычно занимает более 20 минут, чтобы приобрести всю дендритную морфологию. На этом снимке показано репрезентативное изображение слоя четырех корковых нейронов щенка P5.
Стрелка указывает на нейрон, который будет проанализирован. Нейроны с размытыми дендритами должны быть удалены из анализа. На этом изображении показано более высокое увеличение изображения указанного нейрона на предыдущем изображении.
Синие наконечники стрел указывают на дендритные наконечники, которые будут отозваны в следующую точку времени, а маленькие белые наконечники стрел указывают на аксон соседней ячейки. Через 4,5 часа дендритные наконечники с синими наконечниками стрел убираются, а дендритические наконечники с желтыми наконечниками стрел удлинены. Здесь показана репрезентативная дендритная морфологическая реконструкция, нейроны, показывающие отключенные дендриты, как показано здесь, должны быть исключены из анализов.
При попытке этой процедуры, важно, чтобы сохранить дуру нетронутыми, во время процесса. Используя эту процедуру, другие методы, как в двигательной визуализации могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с моделью активности нейронов в неонатальном мозге.
