Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия представляет собой одномолекулярную методику, основанную на лазерном пинцете, которая позволяет исследовать хемомеханику двигателей миозидов под нагрузкой с наивысшим временным разрешением. Этот метод позволяет зондировать очень быстрые события в производстве силы, поддерживая постоянную силу во время каждой фазы моторного взаимодействия с полным контролем направленности силы. Внеся соответствующие коррективы, этот протокол может быть легко применен к другим видам процессных двигателей, включая кинезины и динеины, чтобы раскрыть регулирование силой.
После установки одного набора акустооптических дефлекторов на линейный транслятор возьмите диафрагму и отрегулируйте ее диафрагму в соответствии с размером задней диафрагмы объектива. Замените объектив на диафрагму, центрированную на резьбовом корпусе объектива. Переместите транслятор в сторону лазерного луча до тех пор, пока часть луча, заблокированная пьезокристаллом, не будет видна после диафрагмы, и поверните транслятор немного назад, пока луч полностью не заполнит диафрагму диафрагму.
Для приготовления шариков кремнезема в пентилацетате сначала разводят 20 микролитров 1,2 микронных 10% твердых шариков кремнезема в 1-1,5 миллилитрах ацетона с вихрем и 30 секундами обработки ультразвуком. После обработки ультразвуком соберите шарики центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу бусины в 1 миллилитре свежего ацетона для второй промывки. После второй промывки ацетоном промыть шарики три раза в 1 миллилитре свежего пентилацетата за промывку в тех же условиях центрифугирования и повторно использовать гранулу в 100 микролитрах 1% нитроцеллюлозы и 900 микролитрах пентилацетата.
Затем используйте чистый пропитанный этанолом кусок лабораторной ткани, чтобы тщательно протереть стеклянную крышку размером 24 x 24 миллиметра, прежде чем использовать чистый пинцет, чтобы промыть стекло непосредственно в этаноле и позволить крышке высохнуть под мягким потоком азота. Вихрь и обжарьте обработанный кремнезем в течение 30 секунд и используйте очищенный этанолом покров 24 x 60 миллиметров, чтобы намазать 2 микролитра раствора из кварцевого бисера на поверхность меньшего покрова. Пока бусины сохнут, очистите слайд размером 26 x 76 миллиметров, как показано на рисунке, и поместите две линии толщиной 60-100 микрон 3-миллиметровой двусторонней наклеенными на длинные края слайда.
Используя чистый пинцет, поместите покрытую бисером крышку на ленту бусинами, обращенными к внутренней части слайд-камеры, и заполните камеру 15-миллимолярным фосфатным буфером и плавающим раствором полистирольного бисера. Затем запечатайте камеру силиконовой смазкой. Чтобы откалибровать соотношение пикселей к нанометру камеры brightfield, получите первое изображение кварцевой бусины на поверхности крышки примерно в 5 микронах от центра поля зрения.
Переместите сцену, чтобы сместить бусину на 10 микрон к центру поля зрения и сделать второе изображение. Рассчитайте константу калибровки камеры, измерив расстояние в пикселях между двумя положениями шарика. Чтобы откалибровать положение ловушки, задержите одну плавающую частицу в одной ловушке и переместите акустооптические дефлекторы с шагом 0,2 мегагерца, получив изображение частицы и соответствующую частоту дефлекторов для каждого шага.
Затем повторите калибровку для второй ловушки таким же образом. Чтобы откалибровать мощность и жесткость ловушки, задерните одну частицу в каждой ловушке и сместите обе ловушки с помощью акустооптических дефлекторов с шагом 0,2 мегагерца, регистрируя броуновское движение частицы в обеих ловушках с помощью квадрантных фотодиодных детекторов и соответствующую частоту акустооптических дефлекторов. Получение калибровочных констант путем подгонки функции Лоренца к степенному спектру записанного броуновского движения.
Чтобы собрать образец для измерения, добавьте 1 миллиграмм на миллилитр биотинилированного BSA в новую камеру с кварцевыми шариками на поверхности крышки. Через 5 минут промыть камеру AB-буфером и добавить в камеру 1 миллиграмм на миллилитр стрептавидина. Через 5 минут промыть камеру, как показано, и добавить 3 наномолярных биотинилированных миозина-5В тяжелый меромиозин в буфер M5B, дополненный 2 микромолярными калмодулином.
Через 5 минут промыть камеру три раза 1 миллиграммом на миллилитр биотинилированного BSA с добавлением 2 микромолярных калмодулинов в буфере AB и подождать 3 минуты после окончательной промывки. Протейте реакционную смесь и запечатайте камеру силиконовой смазкой. Чтобы измерить образец, поместите камеру на ступень микроскопа и переместите объектив до тех пор, пока плавающие альфа-актининовые шарики не окажутся в фокусе.
Включите одну ловушку и поймайте одну бусину. Как только первая ловушка занята, переместите транслятор, чтобы расположить захваченную бусину близко к поверхности крышки, чтобы избежать захвата нескольких бусин, и поймайте бусину во второй ловушке. Вытесните образец через трансляторы дальнего действия, чтобы найти актиновые нити длиной не менее 5 микрон в растворе.
Когда нить накала была обнаружена, переместите образец, чтобы захваченная бусина приблизилась к одному концу нити. После того, как нить накала была прикреплена, отрегулируйте расстояние бусины до приблизительной длины нити и переместите ступень, чтобы создать поток в направлении несвязанного шарика. Нить накала будет растягиваться потоком и в конечном итоге связываться со второй бусиной.
Полученный комплекс называется гантелью«Чтобы установить контакт актин-миозин, аккуратно разделите две ловушки и установите нить на уровень претензии примерно до 3 пиконьютонов. Чтобы исследовать жесткость гантели, заставьте одну ловушку колебаться в треугольной волне, изменяя частоту одного акустооптического дефлектора и проверяя последующую передачу движения на замыкающий шарик через сигнал его положения. Переместите сцену, чтобы расположить гантель в непосредственной близости от пьедестала кварцевой бусины и отрегулируйте высоту гантели так, чтобы нить актина соприкасалась с поверхностью кварцевого шарика.
Как видно из этой репрезентативной записи положения, когда миозиновый двигатель не взаимодействует с актиновой нитью, захваченные шарики движутся с постоянной скоростью против вязкой силы сопротивления раствора. Как только миозиновый двигатель начинает взаимодействовать с нитью, сила, переносимая движущейся нитью, очень быстро передается белку, и скорость системы падает до нуля, причем события шага происходят под постоянной силой до конца пробега. Сила переключается с положительного на отрицательное направление системой обратной связи, которая переключает направление силы, когда шарик достигает края диапазона колебаний, заданного пользователем.
Когда миозин связывает и смещает нить накала в положительном направлении, он толкает шарик к верхнему краю диапазона колебаний. Если это происходит под действием вспомогательной силы, то бег миозина будет прерван инверсией направления силы на краю колебания, ограничивая длину пробега амплитудой колебаний гантели. Точное выравнивание оптической системы необходимо для достижения оптимального пространственного и временного разрешения, в то время как точная калибровка необходима для точного определения значений приложенных сил.
Этот метод был адаптирован для изучения скользящего и целенаправленного поиска факторов транскрипции в ДНК, а также динамических взаимодействий между белками механотрансдукции, индуцированными по нитям микротрубочек.
