Моя лаборатория занимается исследованиями COVID-19, и недавно мы разработали новый анализ, который позволил нам быстро и точно обнаружить антитела к SARS-CoV-2. Этот протокол описывает высокопроизводительный анализ для обнаружения антител против SARS-CoV-2 в образцах сыворотки пациентов, что имеет решающее значение с учетом текущей пандемии. Большинство современных серологических анализов жертвуют скоростью ради чувствительности или наоборот.
Наши данные показывают, что наш анализ чувствителен и имеет быстрое время отклика. Для того чтобы произвести достаточное количество биорепортера с высоким содержанием HiBiT-RBD, начните с подготовки к культуре клеток. Во-первых, приготовьте полную модифицированную орлиную среду Dulbecco, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина и стрептомицина.
Затем прогрейте среду на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Включите шкаф биологической безопасности и используйте 70% этанол для стерилизации поверхности шкафа. Чтобы культивировать клеточную линию, выньте ее от минус 80 градусов по Цельсию или жидкого азота и разморозьте на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия.
Смешайте размороженные клетки с содержанием не менее 10 миллилитров полной среды. Пипетка клеточной суспензии в 15-сантиметровую чашку Петри и закрутите пластину, чтобы распределить ячейки равномерно. Поместите блюдо в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и влажности от 85 до 95%.
Наблюдают за клетками под микроскопом до тех пор, пока уровень сливания не достигнет от 80 до 90% При высокой стечении удаляют среду, промывают клетки теплым PBS и добавляют от трех до пяти миллилитров 0,25% трипсина-ЭДТА для отделения клеток от поверхности. Примерно через пять минут посмотрите на клетки под микроскопом. Если все клетки плавают, добавьте не менее четырех миллилитров среды и перенесите клеточную суспензию в новую стерильную трубку.
Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и добавьте один миллион клеток в каждую лунку шестилуночной пластины для трансфекции. Для выполнения трансфекции плазмиды HiBiT-RBD используйте один микрограмм экспрессионной плазмиды HiBiT-RBD с подходящим трансфекционным реагентом. Инкубировать в течение 10-15 минут при комнатной температуре, затем добавить общий объем к каждой лунке пластины по каплям.
На следующий день замените среду, содержащую трансфекционную смесь, на полную среду. Хорошо наблюдают за контролем трансфекции через 48 часов после трансфекции. Соберите супернатант в 1,5 миллилитровых микротрубках.
Добавьте 500 микролитров 1X пассивного лизисного буфера или PLB к клеткам, затем инкубируйте и встряхните пластину в течение 15 минут при комнатной температуре для лизиса клеток. Затем, чтобы оценить сигнал люминесценции от биорепортера с помощью анализа люциферазы, сначала подготовьте компоненты реакции и используйте супернатант в качестве источника биорепортера. Разбавьте большой BiT и субстрат до 1X перед использованием.
Перенесите 50 микролитров супернатанта из каждой скважины или трубы в 96-луночную пластину и добавьте 50 микролитров 1X большого BiT в каждую скважину. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Откройте программное обеспечение люминометра, добавьте 50 микролитров подложки 1X в каждую скважину, поместите пластину в люминометр и запустите программное обеспечение.
Чтобы выполнить анализ обнаружения антител HiBiT-RBD, подготовьте биорепортер HiBiT-RBD, как описано ранее, и объедините 50 микролитров HiBiT-RBD, содержащего супернатант, с одним микрограммом коммерческого антитела SARS-CoV-2 RBD в микропробирке объемом 1,5 миллилитра. Добавьте в раствор 20 микролитров иммуноглобулинсвязывающего белка или белка G. Доведите общий объем до 300 микролитров, добавив PBS.
Инкубируйте трубки на шейкере или ротаторе в течение 30 минут. Центрифуга при 12 000 G в течение 30 секунд. Затем выбросьте супернатант и смойте PBS.
Повторите этот процесс три раза, чтобы удалить свободный HiBiT-RBD. Повторно суспендируйте ячейки в 50 микролитрах PBS и перенесите их на 96-луночную пластину. Добавьте 50 микролитров 1X большого BiT и подождите пять минут.
Затем добавьте 50 микролитров подложки 1X NanoLuc. Сразу же считывает сигнал люминесценции с помощью люминометра. Подготовьте большие количества биорепортера HiBiT-RBD для анализа с высокой пропускной способностью и объедините 20 микролитров магнитного белка G с 50 микролитрами супернатанта HiBiT-RBD в каждой скважине 96-луночной пластины для каждого образца.
Добавьте 10 микролитров образца сыворотки в каждую лунку и доведите общий объем до 150 микролитров, добавив PBS. Инкубировать в течение 30 минут на шейкере при комнатной температуре. Затем поместите пластину на магнитную шайбу, чтобы вывести в осадок комплекс антител белка G.
Выбросьте раствор в средней секции каждой лунки и добавьте PBS для промывки. Повторите этап стирки не менее трех раз, чтобы удалить избыток HiBiT-RBD. Добавьте 50 микролитров 1X PBS и 50 микролитров 1X большого BiT и инкубируйте в течение не менее пяти минут при комнатной температуре.
Подготовьте программное обеспечение люминометра. Затем добавьте 50 микролитров подложки 1X. Поместите пластину в машину, запустите программное обеспечение и запишите сигналы.
Сравните сигналы от образцов сыворотки, контрольных образцов и фонового сигнала из пустых скважин. Сигналы как от HiBiT-RBD, содержащего клеточный лизат, так и от супернатанта трансфектированных клеток были записаны для оценки соответствующего источника белка. Данные показали низкий фон по сравнению с сильным сигналом, когда обе части были объединены.
Добавление белка G способствует осаждению антител. Анализ использовался для сравнения сигнала от коммерческого нейтрализующего антитела SARS-CoV-2 с контрольным IgG. Специфический сигнал антитела был надежным, в то время как контрольное антитело имело близкий к люминесцентному фоновому уровню.
Рекомбинантный ослабленный онколитический вирус везикулярного стоматита или VSV с мутацией в позиции 51 белка М, экспрессирующего экзогенный RBD, использовался для вакцинации мышей. Сыворотка, собранная у вакцинированных мышей, производила надежный сигнал по сравнению с отсутствием сигнала у мышей, которым вводили контрольный VSV. Этот протокол может быть использован для обнаружения антител к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки крови пациента.
Этапы промывки после инкубации с белком G имеют решающее значение для снижения фона. Кроме того, важно добавить подложку как можно быстрее, чтобы избежать потери сигнала. С помощью нескольких дополнительных шагов оптимизации тот же анализ может быть использован для анализа образцов крови и может быть эффективным методом определения антител против SARS-CoV-2 в образцах крови пациентов.
