Насколько нам известно, это первый пример протокола мультиплексирования на основе шариков, который использует два репортерных сигнала для одновременного измерения двух результатов на анализируемый. Этот метод позволяет пользователю измерять антиген-специфические IgM и IgG одновременно, с меньшим количеством образца и более коротким временем до результатов. Хотя этот метод двойного репортера является специфическим для изотипирования антител, он может быть адаптирован для измерения других пар анализируемых веществ, таких как постпереклятивные модификации или свободные и связанные лекарственные формы.
Сегодня мы демонстрируем нашу процедуру доктором Стивом Анджелони, старшим научным сотрудником по полевым приложениям корпорации Luminex. Чтобы начать серологический анализ IgG и IgM с двойным репортером, подготовьте необходимые мультиплексные бисероплетения из отдельной пары бусин и контролируйте запасы бусин в концентрации от одного раза 10 до шести бусин на миллилитр. Затем разбавляют образцы сыворотки в 100 раз, добавляя 10 микролитров сыворотки к 990 микролитрам буфера PBS-TBN, затем разбавляют образцы еще в десять раз, добавляя 20 микролитров разведения 1:100 к 180 микролитрам PBS-TBN.
Когда шариковые смеси и образцы сыворотки будут готовы, добавьте 50 микролитров мультиплексных шариковых смесей в назначенные лунки 96-луночной несвязывающей микротитровой пластины, затем добавьте 50 микролитров разбавленных образцов сыворотки в соответствующие лунки. После того, как все образцы будут добавлены, накройте пластину уплотнением из микропластини и инкубировать на нагретом пластинчатом шейкере при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем отделите шарики от реакционной смеси, поместив пластину на сепаратор магнитных пластин в течение двух минут.
Держа пластину на магните, снимите фольгированную пломбу. Затем осторожно перевернуть пластину над контейнером для отходов и осторожно вытащить супернатант из колодцев. Все еще удерживая пластину на магните, промойте пластину на абсорбирующей бумаге.
Чтобы промыть реакционные колодцы, снимите пластину с пластинчатого магнита и добавьте в каждую скважину по 150 микролитров PBS-TBN. Накройте тарелку уплотнением из свежей фольги и высиживайте на нагретом шейкере в течение двух минут, прежде чем поместить ее обратно на магнит пластины еще на две минуты. Удерживая пластину на магните, переверните пластину, чтобы отбросить супернатант, и промойте пластину на абсорбирующей бумаге.
После второй промывки PBS-TBN снимите пластину с магнита и добавьте в каждую лунку 100 микролитров свежей смеси реагентов Detection. После покрытия пластины уплотнением из микропластичной фольги поместите ее на нагретый пластинчатый шейкер на 15 минут, а затем на магнитную пластинчатый сепаратор на две минуты. Пока пластина находится на магните, отбросьте смесь реагента обнаружения, переверните пластину над контейнером для отходов и промокав ее на абсорбирующей бумаге.
Промыть реакционные колодцы PBS-TBN в два раза, как было показано ранее, затем снять пластину с магнита. Добавьте 100 микролитров PBS-TBN в каждую лунку, затем накройте пластину фольгированной пломбой и встряхните в течение двух минут при 37 градусах Цельсия. Снимите уплотнение из фольги и приступайте к считываемости 50 микролитров образца из каждой скважины в анализаторе потока.
Чтобы прочитать табличку, выберите раскрывающееся меню в левом верхнем углу, перейдите в раздел Конфигурация пластины, загрузите ранее настроенную пластину и выберите Запустить пластину. Извлеките держатель пластины, выбрав значок «Извлечь», затем загрузите пластину на держатель пластины и выберите значок «Втянуть», чтобы втянуть держатель пластины. После того, как держатель пластины затянется в анализатор, выберите значок Выполнить, чтобы начать чтение пластины.
Для анализа двойной репортерной нейтрализации добавьте 50 микролитров мультиплексных шариковых смесей в назначенные скважины 96-луночной необязывающей микротитровой пластины, затем добавьте 25 микролитров по два микрограмма на миллилитр ACE2 к каждой лунке и покройте пластину фольгированным уплотнением. После двухминутной инкубации на нагретом пластинчатом шейкере добавить в назначенные лунки 25 микролитров разведения сыворотки 1:500. После того, как все образцы были добавлены, выполните этапы инкубации, промывки, обнаружения и анализа, как было ранее продемонстрировано для серологического анализа.
Тест анти-IgM, конъюгированный с репортерным красителем DyLight 405 с использованием образцов сыворотки в течение пяти-60 дней с момента появления симптомов и образца сыворотки IgG strip, не дал высокого сигнала для спайкового антигена. Для образцов с высокой интенсивностью флуоресценции среды IgM самые высокие сигналы наблюдались для рецепторсвязывающего домена и антигенов нуклеокапсида. Хотя титр IgM должен был быть повышен в некоторых образцах, наблюдаемые уровни интенсивности флуоресценции среды не превышали 140 единиц МФО.
Кроме того, контрольной шарику для IgM не хватало значительного динамического диапазона для средней интенсивности флуоресценции при использовании DyLight 405, сопряженного с анти-IgM, по сравнению с фикоэритрином, меченым анти-IgM в той же концентрации. Для обнаружения IgG блестящий фиолетовый конъюгат имел более высокие сигналы средней интенсивности флуоресценции, чем стрептавидиновый конъюгат флуофора Super Bright 436. Однако интенсивность сигнала для блестящего фиолетового сопряжения варьировалась в зависимости от титрования ACE2.
Это колебание сигнала блестящим фиолетовым конъюгатом в концентрациях ACE2 также мешало определению процента ингибирования ACE2 в диапазоне титров IgG. Для обнаружения IgM фикоэритрин анти-IgM отображал более высокие сигналы, чем те, которые генерирулись DyLight 549 античеловеческим IgM. При определении ACE2-процентного ингибирования связывания IgM наблюдалась небольшая, но незначительная разница между двумя реагентами обнаружения IgM.
Таким образом, одним из наиболее важных шагов в процедуре является приготовление смеси мультиплексных бусин из ваших индивидуальных бусин и убедитесь, что вы делаете это правильно. Таким образом, эта процедура также может быть использована для измерения эффективности вакцин и мониторинга иммунных реакций на другие патогены.
